斑馬魚tmp3,hprg1b和cxxc5基因在心臟發(fā)育中的功能研究.pdf

1、先天性心臟病是新生兒出生缺陷中發(fā)病率和死亡率最高的疾病，研究表明心臟發(fā)育調控基因的表達異常是導致先天性心臟病的內在原因。闡明心臟在早期發(fā)育過程中的基因調控機制就成為治療先天性心臟病的關鍵。隨著斑馬魚成為研究發(fā)育生物學和功能基因組學的脊椎動物模型，利用該模型可為探究心臟的早期發(fā)育和先天性心臟病發(fā)生的分子調控機制提供行之有效的研究策略。本文主要利用斑馬魚模型研究了tmp3，hprg1b和cxxc5基因在心臟早期發(fā)育過程中的調控功能。

2、　　一、tmp3基因在心臟發(fā)育中的功能研究
　　tmp3基因為實驗室早期克隆的一個心臟發(fā)育候選基因，本文利用Tol2轉座系統(tǒng)構建了tmp3啟動子驅動的EGFP表達轉基因斑馬魚品系Tg(tmp3: EGFP)，簡稱tmp3EGFP。追蹤該轉基因斑馬魚中EGFP的表達發(fā)現(xiàn)，在受精后36，48和56小時(hpf) Tmp3蛋白主要強表達于心臟和骨骼肌中。原位雜交技術檢測EGFP早期表達信號發(fā)現(xiàn)在40％外包時，表達信號定位于卵裂球邊緣生心

3、區(qū);22體節(jié)時，信號定位于心錐和骨骼肌;24 hpf，信號定位于心管和骨骼肌;48 hpf，信號定位在骨骼肌和跳動的心臟中。將Tg(tmp3: EGFP)魚與標記心內膜層細胞的Tg(fli1a: DSRED)魚及標記心肌層細胞的Tg(myl7:DSRED)魚分別雜交，對發(fā)育到72 hpf的雙轉基因斑馬魚進行激光共聚焦顯微鏡單層切面掃描，結果顯示心臟中的tmp3基因表達只定位于心肌層。
　　利用TALEN打靶技術構建的tmp3基因敲

4、除斑馬魚品系進行Westernblot檢測證明，tmp3敲除陽性個體中沒有相應的功能型蛋白合成。觀察tmp3敲除純合子的表型發(fā)現(xiàn)，tmp3敲除斑馬魚表現(xiàn)為心包腫大，心臟腔室減小，環(huán)化異常和軀干發(fā)育異常。觀察Tg(myl7: DSRED;flk1:EGFP)雙轉基因tmp3敲除斑馬魚的表型發(fā)現(xiàn)，tmp3基因敲除導致斑馬魚心臟腔室減小和房室通道縮窄。為了探究心臟腔室的減小是由于心肌細胞大小的減小還是由于數(shù)目的減少導致的，利用細胞膜緊密連接蛋

5、白ZO-1的抗體標記細胞膜，檢測tmp3敲除斑馬魚心臟細胞的大小，結果表明tmp3敲除魚心臟中的細胞大小并未發(fā)生顯著變化。另外，通過肌球蛋白重鏈MHC抗體和核內DNA染料DAPI對心肌細胞染色并計數(shù)發(fā)現(xiàn)，48hpf tmp3敲除魚心臟中心肌細胞的數(shù)量顯著減少。證明tmp3基因敲除斑馬魚心臟腔室的變小是由于心肌細胞數(shù)量減少導致。Edu細胞增殖分析結果顯示tmp3基因敲除后增殖的幼魚心肌細胞數(shù)量顯著減少。而TUNEL凋亡細胞分析結果顯示tm

6、p3敲除幼魚心臟細胞的凋亡并未發(fā)生顯著變化。由此證明tmp3基因通過影響心肌細胞的增殖從而調控斑馬魚早期心臟發(fā)育。
　　本實驗室早期通過酵母雙雜交和COIP相互作用分析篩選出與Tmp3蛋白相互作用的蛋白分子Creb2，那么Tmp3蛋白是否通過與Creb2相互作用從而調控心臟發(fā)育呢？本文利用免疫熒光和激光共聚焦掃描檢測斑馬魚胚胎心臟內源Tmp3與Creb2蛋白的表達發(fā)現(xiàn)，這兩個蛋白在72 hpf的幼魚心臟中存在共定位。進一步的免疫熒

7、光實驗證明在H9c2大鼠心肌細胞中TMP3蛋白與CREB2蛋白共定位于心肌細胞的細胞核中。接下來，用免疫熒光檢測了誘導向心肌細胞分化的P19小鼠畸胎瘤干細胞在誘導第6天和第10天內源Tmp3和Creb2蛋白的定位。發(fā)現(xiàn)在誘導第6天兩種蛋白大部分共定位在細胞質中，而在誘導第10天這兩種蛋白共定位在細胞核中。提示隨著胚胎細胞向心肌細胞分化，Tmp3與Creb2兩種蛋白逐漸從細胞質遷移到細胞核中，提示這兩個蛋白的入核進程可能與心肌細胞的發(fā)育過

8、程相關。由于Tmp3是一個不具備入核信號的跨膜蛋白，為探究Tmp3是否依賴與Creb2的相互作用入核，構建tmp3全長熒光質粒發(fā)現(xiàn)該質粒在細胞核與細胞質中均有表達，而除去與Creb2相互作用結構域(134-240AA)后的截短體蛋白Tmp3熒光質粒僅定位在細胞質中。由此證明，Tmp3蛋白是通過與Creb2蛋白相互作用介導入核的。
　　早期心肌細胞增殖和分化的關鍵調控因子gata4敲減的斑馬魚胚胎與tmp3基因敲除斑馬魚表現(xiàn)出類似的

9、心臟缺陷表型，提示gata4可能是Tmp3-Creb2復合物的下游調控靶標。本文利用RT-qPCR檢測了tmp3敲除斑馬魚胚胎中gata4及其調控心肌細胞增殖的下游因子ccnd2a和cdk4拘表達。結果表明，gata4，ccnd2a和cdk4在tmp3敲除斑馬魚中均顯著下調。由此提示gata4可能是Tmp3-Creb2復合物的下游靶標。另外在tmp3基因敲除斑馬魚一細胞期顯微注射gata4mRNA可以一定程度上拯救心臟的發(fā)育畸形，從而進

10、一步證明gata4為Tmp3-Creb2復合物調控早期心臟發(fā)育的下游靶標。利用RT-qPCR技術檢測法洛式四聯(lián)癥(TOF)病人心肌組織中TMP3 mRNA的表達量發(fā)現(xiàn)TOF病人心肌組織中TMP3 mRNA的水平顯著下調。隨后通過測序分析在TOF病人中檢測到一個TMP3基因的錯義突變(c.820C＞T，p.R274C)。將突變的TMP3質粒(R274C，TMP3m)轉染到H9c2細胞中，利用熒光報告系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)GATA4基因的上游應答元件

11、CRE-luc熒光報告基因的轉錄活性較野生型對照組顯著降低。而且western blot檢測發(fā)現(xiàn)TMP3m轉染的H9c2細胞中GATA4蛋白的表達量也顯著降低。由此可見，TMP3m突變可能通過影響GATA4蛋白的表達從而參與TOF的發(fā)病機制。
　　二、hprg1b基因在心臟發(fā)育中的功能研究
　　hprg1b基因是實驗室前期通過果蠅P因子突變篩選出的另一個早期心臟發(fā)育候選基因。本文為了追蹤hprg1b基因在心臟早期發(fā)育過程中的

12、時空定位，利用Tol2轉座系統(tǒng)構建了hprg1b啟動子驅動EGFP蛋白表達的轉基因斑馬魚品系Tg(hprg1b: EGFP)，簡稱1bEGFP。追蹤胚胎發(fā)育過程中綠色熒光信號的表達發(fā)現(xiàn)在16hpf hprg1b基因的表達信號定位于側板中胚層兩側的心臟原基中，隨后在20hpf兩側綠色熒光信號在心錐區(qū)域融合，在24hpf定位于心管的位置，48hpf后信號在心臟中檢測到。由此可見，hprg1b基因的時空表達譜與早期心臟的形態(tài)建成區(qū)域一致。本文

13、將1bEGFP轉基因斑馬魚分別與Tg(myl7:DSRED)和Tg(kdr1:MCHERRY)轉基因斑馬魚雜交后得到Tg(1bEGFP;myl7DSRED)和Tg(1bEGFP;kdrlMCHERRY)雙轉基因斑馬魚，觀察72 hpf的轉基因斑馬魚心臟發(fā)現(xiàn)Hprg1b蛋白表達只定位于心肌層。進一步檢測75hpf的Tg(1bEGFP; myl7DSRED)雙轉基因斑馬魚心臟發(fā)現(xiàn)hprg1b強表達于流出道，房室通道和流入道處。此時心臟的3D

14、立體圖像顯示hprg1b只在一部分心肌細胞細胞中表達。流氏細胞儀分析2個月大的Tg(1bEGFP; myl7DSRED)轉基因斑馬魚原代心臟細胞發(fā)現(xiàn)，hprg1b陽性細胞只占心臟細胞的10.7％，從而提示hprg1b陽性細胞可能是一種特殊的心肌細胞。
　　本文構建了hprg1b過表達質粒pCV/hf，將該質粒轉染進入斑馬魚干細胞系Z428中。RT-PCR初步檢測發(fā)現(xiàn)hprg1b過表達質粒轉染1天后Z428細胞中早期心肌細胞標記基因

15、gata4和nkx2.5，心內膜早期標記基因etv2和心肌細胞分化標記基因myh6的表達均出現(xiàn)明顯的上調。進一步用ddPCR技術精確定量這四個基因在hprg1b過表達的Z428細胞中的表達變化，發(fā)現(xiàn)在hprg1b過表達1天后四個基因的表達與對照組相比均顯著上調;2天后，nkx2.5，gata4和myh6的表達均持續(xù)增加，但etv2的表達開始下調;第三天，3個心肌細胞標記基因的表達持續(xù)上調，但心內膜標記基因etv2卻持續(xù)下調。由此推斷，h

16、prg1b是通過持續(xù)誘導心肌細胞早期標記基因的表達，從而調控胚胎干細胞向心肌細胞分化進而調控心臟發(fā)育的。
　　三、cxxc5基因在心臟發(fā)育中的功能研究
　　CXXC5(CXXC-typezinc-finger protein5)被報道在其表達的組織中發(fā)揮廣泛的生理和病理學功能。以往的研究表明CXXC5在心臟中高表達，并且CXXC5與病理性和生理性心肌重構相關，提示CXXC5很可能在心臟發(fā)育、心肌分化和心臟疾病的發(fā)病機理中發(fā)揮

17、重要作用。盡管如此，至今仍缺乏一個直接的證據(jù)闡明CXXC5在心臟中的功能。生物信息學分析表明CXXC5的功能結構域在進化上高度保守，因此利用斑馬魚模型探究CXXC5在早期胚胎心臟發(fā)育中的功能可為人類早期心臟發(fā)育關鍵調控因子的篩選提供線索。
　　本文利用RT-PCR檢測cxxc5基因在斑馬魚早期胚胎中的表達，發(fā)現(xiàn)cxxc5在40％外包時起始表達，并持續(xù)表達于胚胎與成體斑馬魚中。原位雜交檢測cxxc5 mRNA的時空表達模式表明cxx

18、c5在40％外包時表達于卵裂球兩側邊緣生心區(qū)，在22體節(jié)時cxxc5表達于心錐，在24hpf表達于心管，在48hpf表達于心臟。cxxc5的時空表達模式提示cxxc5可能參與調控斑馬魚早期心臟發(fā)育。Morpholino敲減cxxc5的表達對心臟發(fā)育產(chǎn)生了顯著的影響。注射了cxxc5MO的胚胎約70％表現(xiàn)出環(huán)化異常，發(fā)育不良和心包水腫的表型。胚胎注射Morpholino后的致死率統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，大部分的cxxc5敲減胚胎在第七天死亡。cxxc5

19、MO與cxxc5加帽mRNA共注射可以在一定程度上拯救cxxc5MO敲減的胚胎表型，說明cxxc5敲減胚胎的表型是由于cxxc5 mRNA表達降低造成的。原位雜交檢測心肌標記基因cmlc2的表達，發(fā)現(xiàn)24hpf的cxxc5敲減胚胎中cmlc2的表達停留在中線，而并未像野生型一樣前端遷移到左眼處。48hpf的cxxc5敲減斑馬魚的心室和心房縱軸間的平均夾角為12°，與野生型的胚胎的平均夾角27°相比顯著減小。本文進一步利用Semi-Aut

20、omated Optical Heartbeat Analysis探究了cxxc5敲減對胚胎心臟的生理學功能的影響。分析表明，cxxc5敲減后，胚胎的心動周期顯著延長，心率顯著減緩，心臟收縮面積改變率顯著減小。由此證明，cxxc5敲減后斑馬魚的心臟功能受損。
　　前期研究表明人類CXXC5與SMADs蛋白(SMAD2，SMAD3)存在相互作用，本文通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)人類的CXXC5，SMAD2和SMAD3與斑馬魚中的同源蛋白高

21、度同源。本實驗室曾利用COIP和GST-pulldown證明了斑馬魚Cxxc5和Smad2，Smad3的相互作用。于是本文分別檢測了TGF-β信號熒光報告質粒CAGA-LUC，BMP信號熒光報告質粒BRE-LUC，和Activin信號熒光報告質粒3TP-LUC在過表達Cxxc5的H9c2細胞中的轉錄活性，結果表明CAGA-LUC和BRE-LUC的熒光活性顯著增強，而3TP-LUC的活性沒有變化，由此提示cxxc5基因在心肌細胞中影響了T

22、GF-β信號和相關的BMP信號。為了找尋到TGF-β信號中Cxxc5-Smads復合物的下游靶點，本文分析了幾個經(jīng)典TGF-β信號下游靶基因nkx2.5，gata4，hand2和has2啟動子區(qū)域中是否包含MH1結合結構域SBE(Smad-binding element，CAGAC)和CpG島。結果表明gata4，hand2和has2的啟動子中均包含Smad-binding element(CAGAC)位點和CpG島。RT-qPCR分析

23、表明cxxc5敲低的斑馬魚中hand2和has2的表達顯著下調。而且胚胎注射hand2加帽mRNA可有效的拯救cxxc5MO導致的心臟環(huán)化缺陷。從而證明cxxc5可能通過TGF-β信號的hand2調控心臟的環(huán)化過程。
　　文獻報道人類CXXC5基因在先天性心臟病患兒術前和術后的表達具有顯著差異，本文利用RT-qPCR檢測了TOF病人中CXXC5的表達，發(fā)現(xiàn)TOF病人中CXXC5 mRNA水平顯著下調，提示CXXC5可能是TOF的臨

24、床診斷候選靶標分子。上述結果表明，斑馬魚cxxc5是在早期心臟發(fā)育中表達的內源性因子，可能在心臟左右不對稱的形態(tài)建成中發(fā)揮重要作用，并且首次在體內證明cxxc5可以通過TGF-β信號調控心臟發(fā)育與心臟環(huán)化。
　　總之，本文利用斑馬魚模型研究了tmp3，hprg1b和cxxc5基因在早期心臟發(fā)育中的功能和分子調控機制，以及其表達與人類心臟疾病法洛氏四聯(lián)癥發(fā)生的關系，該研究豐富了有關心臟發(fā)育的分子調控理論，為先天性心臟病的臨床診斷提供