利用WISH技術(shù)研究斑馬魚TMP3和FHLA基因在心臟和骨骼肌發(fā)育中的作用.pdf

1、脊椎動物的心臟是最早出現(xiàn)并表現(xiàn)出功能的器官之一。它的發(fā)育過程極其復(fù)雜，受到一系列心臟發(fā)育相關(guān)基因的精確調(diào)控。這些基因發(fā)生異常將會導(dǎo)致先天性心臟病，嚴重的將會導(dǎo)致胚胎的死亡。目前對心臟發(fā)育過程中牽涉到的分子機制仍然不清楚，因此，研究調(diào)控心臟發(fā)育候選基因的功能及其作用的分子機制具有重要的理論與臨床應(yīng)用意義。本文以斑馬魚為模式生物，利用原位雜交技術(shù)研究了TMP3對心臟發(fā)育及FHLA對骨骼肌發(fā)育的作用。
　　TMP3在心臟和肌肉中特異性高

2、表達，其是否影響心臟的發(fā)育尚不得而知。本文以斑馬魚為模型，利用整體胚胎原位雜交技術(shù)(WISH)對其在心臟發(fā)育中的功能進行了研究。我們首先用報告基因EGFP為探針，在斑馬魚TMP3-enhancer品系中做原位雜交，得到了TMP3基因的胚胎表達譜。接著以心房標記基因amhc為探針，在斑馬魚胚胎發(fā)育22ss，24hpf和48hpf階段做原位雜交，結(jié)果顯示:敲低TMP3導(dǎo)致心房變小，共注射TMP3 mRNA能拯救TMP3敲低導(dǎo)致的心房變小表型

3、。由于我室證明TMPA4是TMP3相互作用蛋白，我們對TMPA4進行了Morpholino敲低研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲低TMPA4導(dǎo)致與TMP3相似的心房變小的心臟畸形，共注射TMPA4 mRNA能拯救TMPA4敲低導(dǎo)致的心房變小表型。我室也證明GATA4是TMP3的直接靶基因。我們以GATA4為探針對5ss胚胎發(fā)育階段的原位雜交結(jié)果顯示:過表達GATA4也能拯救單敲低TMP3、TMPA4以及共敲低TMP3和TMPA4引起的GATA4表達下調(diào)的

4、表型。進一步分別用心臟標記基因cmlc2，心室標記基因vmhc和心房標記基因amhc標志為探針進行分析的結(jié)果顯示:GATA4確實能拯救單敲低TMP3和TMPA4以及共敲低TMP3和TMPA4導(dǎo)致的心臟變小的表型。
　　人類FHL1基因與骨骼肌疾病的發(fā)生相關(guān)。斑馬魚FHLA基因是其同源基因，其是否影響骨骼肌的發(fā)育未知。我們首先合成了FHLA探針，在斑馬魚中做原位雜交，本文結(jié)果顯示，在體節(jié)發(fā)育時期，F(xiàn)HLA在骨骼肌特異表達。敲低FHL

5、A將會導(dǎo)致骨骼肌的發(fā)育出現(xiàn)異常。注射FHLA mRNA能夠拯救該缺陷表型。那么，骨骼肌的異常是否是由慢肌發(fā)育異常引起的呢？于是，我們用用F59和4D9抗體做胚胎抗體染色，結(jié)果顯示:FHLA是慢肌發(fā)育所必需的，但不影響慢肌前體細胞。因為衛(wèi)星細胞是出生后動物骨骼肌生長和再生的主要細胞來源，而pax7在衛(wèi)星細胞系的特化過程中是必不可少的，因此我們用pax7抗體做了胚胎抗體染色，結(jié)果顯示FHLA影響衛(wèi)星細胞的發(fā)育。最后，我們的結(jié)果還顯示RA信號