Wdpcp基因在心臟及冠脈發(fā)育中的實驗研究.pdf

1、先天性心臟發(fā)育畸形是兒童主要的致死性疾病之一，其遺傳學機制目前仍舊不甚清楚。本研究運用基因遺傳工具對Wdpcp基因?qū)е碌囊幌盗行呐K異常表型，包括房、室間隔缺損，肺動脈閉鎖，流出道障礙，冠脈發(fā)生障礙等，進行實驗研究。力圖揭示該基因與心臟發(fā)育之間的關系。
　　第一部分，我們將正常的IMDC3細胞進行培養(yǎng)，然后進行Wdpcp蛋白及微管蛋白的免疫熒光染色。結(jié)果表明，Wdpcp蛋白與微管共同構(gòu)成了纖毛，是纖毛的組成部分。因此證實Wdpcp基

2、因是一個與纖毛生長有關的基因。
　　第二部分，用Gli1LacZ/+小鼠示蹤Hh信號通路的標志物Gli1在Wdpcp基因突變鼠中的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型鼠胚E11.5d的心臟的DMP結(jié)構(gòu)有表達，但在Wdpcp基因突變鼠中表達明顯降低，DMP結(jié)構(gòu)也發(fā)育不良。由于DMP結(jié)構(gòu)是發(fā)育成原發(fā)房間隔的重要組織，其形成受Hh信號通路的調(diào)控，因此能夠推論Wdpcp小鼠的心房間隔發(fā)育畸形與Hh信號通路相關。另外我們發(fā)現(xiàn)E11.5d的突變小鼠胚胎第六咽

3、弓動脈完全缺如，而以 Wdpcpcyst40/+，Gli1LacZ/+小鼠來示蹤流出道的細胞，發(fā)現(xiàn)野生型小鼠流出道有大量Gli1表達陽性細胞，而突變鼠在同一位置沒有Gli1基因的表達。我們推論因咽弓動脈缺如，導致 Hh信號通路受阻，心臟神經(jīng)棘細胞無法正常的遷移至流出道，進行生長。
　　第三部分，我們觀察到Wdpcp基因突變鼠E18.5d的冠脈前降支短小、分支稀疏甚至消失、發(fā)育明顯障礙。我們用內(nèi)皮細胞特異性抗體CD31進行PECAM

4、染色，發(fā)現(xiàn)在E12.5d、E13.5d、E14.5d均沒有明顯的血管生成障礙。我們又針對該階段的胚胎心臟進行了一系列和冠脈發(fā)育相關的細胞因子檢測，將E13.5d小鼠胚胎心臟的RNA提取出來，對Gli1、Gli2、Gli3、Shh、Patch1等相關因子進行定量檢測，沒有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學差異。但是在進行的EMT的標志物檢測方面，發(fā)現(xiàn)了差異。Wdpcp基因突變鼠Snail1、Snail3、Twist1表達均有顯著性降低。Snail1是最主要的EM

5、T標志物，其受到上游Wt1的調(diào)控。為了確認這一發(fā)現(xiàn)，我們利用Wt1CreERT2/+,Rosa26mTmG作為工具，在雌鼠孕10.5天時注射雌激素，通過綠色熒光示蹤表達Wt1的心外膜細胞和心外膜來源的細胞在孕15.5天時的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型小鼠胚心心外膜，心外膜下間質(zhì)的綠色熒光明顯多于Wdpcp基因突變鼠胚心。該結(jié)果能夠直觀的說明Wdpcp基因突變鼠胚心心外膜來源細胞減少，心外膜EMT受到影響，這會導致平滑肌細胞生成減少，冠脈在重構(gòu)階