Numb蛋白家族在心臟發(fā)育中的作用.pdf

1、研究背景及研究目的：
　　脊椎動(dòng)物心臟是在胚胎發(fā)育過(guò)程中最早形成并發(fā)揮功能的器官。心臟發(fā)育是一個(gè)極其精準(zhǔn)而復(fù)雜并且時(shí)空相關(guān)的過(guò)程，其間涉及一系列關(guān)鍵事件的發(fā)生，這些關(guān)鍵事件受多條信號(hào)通路在時(shí)間和空間上的精準(zhǔn)調(diào)控，任何環(huán)節(jié)調(diào)控失衡都將會(huì)影響心臟功能的正常發(fā)揮并誘發(fā)先天性心臟病。
　　Numb家族蛋白（NFPs）是一個(gè)細(xì)胞命運(yùn)決定子，其家族包括Numb和Numblike（Numbl）。最新研究表明NFPs缺失導(dǎo)致小鼠胚胎流出道形

2、成缺陷，暗示NFPs在流出道發(fā)育過(guò)程中的重要作用，但其機(jī)制尚不明確。同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)在Numb和Numbl雙基因敲除的胚胎心臟中，Notch1信號(hào)通路被異位激活，暗示NFPs在心臟發(fā)育過(guò)程中的功能可能依賴Notch1信號(hào)通路。我們通過(guò)應(yīng)用Cre-loxp系統(tǒng)在心肌祖細(xì)胞中特異性敲除Numb、Numbl和Notch1得到Numb、Numbl雙重基因敲除胚胎和Numb、Numbl、Notch1的三重基因敲除胚胎，探討Notch1信號(hào)通路與N

3、FPs在心臟發(fā)育過(guò)程中的關(guān)系。在研究過(guò)程中，我們還發(fā)現(xiàn)，在Numb、Numbl雙重基因敲除胚胎的心臟中，Hey2的表達(dá)發(fā)生改變，因此我們對(duì)影響Hey2在心臟中的表達(dá)水平和表達(dá)模式的信號(hào)通路進(jìn)行了深入的研究和探索1。
　　本研究將在一定程度上闡明NFPs在心臟流出道形成過(guò)程中的功能及其調(diào)控機(jī)制并確定NPFs在心臟小梁的形成過(guò)程中如何依賴Notch1信號(hào)通路發(fā)揮作用，同時(shí)闡明Hey2在心臟發(fā)育過(guò)程中的時(shí)空表達(dá)方式，將有助于人們進(jìn)一步認(rèn)

4、識(shí)了解先天性心臟病，為其治療和干預(yù)提供研究基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.特異性基因敲除小鼠的建立：我們通過(guò)Cre-loxp系統(tǒng)建立所需要的特異性基因敲除胚胎。我們通過(guò)心臟特異性表達(dá)的Nkx2.5cre/+、心內(nèi)膜特異性表達(dá)的Nfatc1cre/+和內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)Tie2-cre分別對(duì)心肌細(xì)胞、心內(nèi)膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中的靶基因進(jìn)行特異性敲除2。
　　2.mRNA deep sequencing和Protein arr

5、ay分析：通過(guò)收集對(duì)照組和突變組胚胎心臟樣品進(jìn)行mRNA deep sequencing和Protein array分析，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析篩選并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，確定有表達(dá)差異的基因及對(duì)應(yīng)的信號(hào)通路。
　　3.機(jī)制分析：
　?。?）利用免疫熒光染色及RNA原位雜交技術(shù)驗(yàn)證相關(guān)基因蛋白和mRNA表達(dá)水平及表達(dá)方式。
　?。?）通過(guò)Western Blot和Q-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證相關(guān)基因的蛋白和mRNA表達(dá)水平。
　?。?）

6、通過(guò)小鼠胚胎體內(nèi)給予FGF2刺激和胚胎體外培養(yǎng)并進(jìn)行FGF2刺激以驗(yàn)證相關(guān)信號(hào)通路對(duì)Hey2表達(dá)水平和表達(dá)模式的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.通過(guò)EdU標(biāo)記檢測(cè)流出道心肌細(xì)胞的增殖，發(fā)現(xiàn)流出道心肌細(xì)胞的增殖具有空間差異性，表現(xiàn)為左右兩側(cè)的心肌細(xì)胞不均等增殖，在 NFPs缺失的情況下，這種表型被打破。
　　2.NFPs缺失的情況下導(dǎo)致Pitx2表達(dá)降低，并且在流出道的表達(dá)模式發(fā)生變化。
　　3.NFPs缺失導(dǎo)致心

7、臟神經(jīng)嵴細(xì)胞數(shù)量減少，其原因和MDKO中心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞的增殖降低有關(guān)。
　　4.NFPs缺失導(dǎo)致第二生心區(qū)祖細(xì)胞增多，且排列紊亂。
　　5.心肌細(xì)胞Notch1敲除能夠部分挽救Numb、Numbl雙基因敲除所導(dǎo)致的小梁形成缺陷。
　　6.心肌細(xì)胞Notch1敲除能夠部分降低Numb、Numbl雙基因敲除所導(dǎo)致的小梁區(qū)心肌細(xì)胞過(guò)度增殖。
　　7.Notch1/β-catenin/Isl1信號(hào)通路在NFPs缺失情況下

8、上調(diào)，在Numb、Numbl、Notch1三重基因敲除的心臟中下調(diào)。
　　8.Hey2在心臟發(fā)育中的表達(dá)具有時(shí)間和空間特異性。
　　9.Notch、Nrg/ErbB2,4和YAP信號(hào)通路在心臟發(fā)育過(guò)程中能夠調(diào)控Hey2表達(dá)水平，但不調(diào)控其表達(dá)模式。
　　10.FGF信號(hào)通路在心臟發(fā)育過(guò)程中調(diào)控Hey2的表達(dá)水平和表達(dá)模式。
　　結(jié)論：
　　1.NFPs通過(guò)影響Nodal-Pitx2信號(hào)通路調(diào)控流出道心肌細(xì)胞