miR-30a調(diào)控的心肌自噬在心臟肥厚中的作用.pdf

1、背景:
　　人類(lèi)對(duì)心力衰竭發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)不斷深入。上世紀(jì)90年代以來(lái)形成的心臟重構(gòu)學(xué)說(shuō)是心力衰竭發(fā)生發(fā)展的基本機(jī)制。心臟肥厚是心臟重構(gòu)的重要環(huán)節(jié)。對(duì)心臟肥厚機(jī)制的進(jìn)一步深入探討可能為我們提供心力衰竭新的防治靶點(diǎn)。
　　心肌細(xì)胞損傷和丟失在心臟肥厚和心臟重構(gòu)中起重要作用。心肌細(xì)胞自噬在心肌細(xì)胞損傷和丟失中起作用。細(xì)胞在缺乏營(yíng)養(yǎng)和能量供應(yīng)時(shí),部分細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞器被包裹進(jìn)一種特異性的雙層膜或者多層膜結(jié)構(gòu)的自噬體中,再與溶酶體融合形成

2、自噬溶酶體,胞質(zhì)和細(xì)胞器成分如蛋白質(zhì)在這里被降解為核苷酸、氨基酸、游離脂肪酸等小分子物質(zhì),這些小分子物質(zhì)可以被重新利用合成大分子或者合成ATP。這就是細(xì)胞自噬。自噬是真核細(xì)胞蛋白質(zhì)降解的重要途徑,其作用主要是清除降解細(xì)胞內(nèi)受損傷的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、衰老的細(xì)胞器及不再需要的生物大分子等,同時(shí)也為細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的構(gòu)建提供原料,即細(xì)胞結(jié)構(gòu)的再循環(huán)。自噬是真核細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、執(zhí)行功能及死亡的重要調(diào)控機(jī)制,與細(xì)胞的許多生理、病理過(guò)程,包括腫瘤、退行性疾病等

3、多種人類(lèi)疾病有關(guān)。一定范圍及程度的自噬可能是細(xì)胞力圖從惡劣條件下得以生存的保護(hù)性機(jī)制。過(guò)度的細(xì)胞自噬或者細(xì)胞自噬不足都會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生。
　　自噬在心血管疾病中作用的研究逐漸被人們關(guān)注。多種心血管疾病的病理過(guò)程均伴隨著心血管系統(tǒng)自噬活性的改變。自噬有維持心血管系統(tǒng)正常生理功能的作用,自噬的異常加速了心血管疾病的發(fā)生。不同水平的自噬對(duì)心血管疾病可能起不同的作用。在疾病的不同階段,自噬所起的作用可能迥異。
　　有研究表明,主動(dòng)脈

4、縮窄所導(dǎo)致的心臟肥厚小鼠,心肌細(xì)胞自噬增強(qiáng)。另有研究發(fā)現(xiàn),自噬不足在老年性心臟肥厚中起作用。有學(xué)者認(rèn)為,基礎(chǔ)水平的心肌細(xì)胞自噬在心臟肥厚和心臟重構(gòu)中是一種適應(yīng)和自我保護(hù)作用。
　　腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin-system,RAS)在心臟重構(gòu)發(fā)生中起重要作用。血管緊張素II(angiotensinII,AngII)是RAS中最主要的生物活性物質(zhì)。研究表明,AngII能引起心肌重構(gòu)和上調(diào)心肌細(xì)胞自噬。那么

5、,AngII是否是通過(guò)上調(diào)心肌細(xì)胞自噬而引起心肌重構(gòu)呢?
　　miRNA是一類(lèi)在生物進(jìn)化過(guò)程中高度保守的非編碼微小RNA,通過(guò)降解目的mRNA或抑制其翻譯,調(diào)節(jié)目的基因表達(dá),進(jìn)而影響細(xì)胞或生物個(gè)體的生理病理狀態(tài)。有報(bào)道,miR-30a能負(fù)調(diào)控腫瘤細(xì)胞株T98G,MDA-MB-468和H1299的自噬相關(guān)基因Beclin-1的表達(dá)而引起細(xì)胞自噬活性的改變。那么,miR-30a是否調(diào)控心肌細(xì)胞自噬?如果miR-30a能調(diào)控心肌細(xì)胞自噬

6、,那么miR-30a調(diào)控的心肌細(xì)胞自噬是否在心臟肥厚中起作用呢?如果該通路起作用,那么患者外周miR-30a是否能作為心臟肥厚的標(biāo)志物呢?
　　我們推測(cè):miR-30a下調(diào)將會(huì)引起自噬相關(guān)蛋白Beclin-1誘導(dǎo)的心肌自噬過(guò)度激活,從而引起心肌肥厚。
　　本研究擬通過(guò)建立心臟肥厚大鼠模型,比較肥厚心臟組織和正常的心臟組織中miR-30a及自噬的變化情況,以闡明miR-30a與心臟肥大及自噬變化的關(guān)系。其次,通過(guò)研究miR-3

7、0a對(duì)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1的調(diào)控情況,以及Beclin-1在AngII誘導(dǎo)的心肌肥厚中的作用等,以闡明miR-30a是否通過(guò)Beclin-1調(diào)節(jié)自噬從而參與心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展。最后,在左室肥厚人群中觀察血漿miR-30a與左室肥厚的關(guān)系,研究血漿miR-30a是否能作為左室肥厚患者臨床診斷的標(biāo)志物。研究結(jié)果對(duì)揭示心臟肥厚的新機(jī)制有重要意義,將為心臟肥厚的防治提供嶄新的科學(xué)思路。
　　第一部分心臟肥厚大鼠心臟自噬和miR-3

8、0的改變
　　目的:
　　觀察壓力超負(fù)荷心臟肥厚大鼠心臟組織中miR-30與自噬的改變。
　　方法:
　　采用腹主動(dòng)脈縮窄(TAAC)SPF級(jí)Wistar大鼠制作心臟肥厚模型。經(jīng)超聲心動(dòng)圖、HE染色、Masson染色確定造模成功。實(shí)時(shí)熒光定量(Real-timePCR,qPCR)檢測(cè)心臟組織miR-30的表達(dá),用Westernblot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3II/LC3I的表達(dá)、用透射電鏡觀察心臟

9、組織自噬泡的變化。
　　結(jié)果:
　　1、手術(shù)4周后觀察,與Sham組大鼠相比較,左心室后壁收縮末期厚度(LVPWs)、室間隔收縮末期厚度(IVSs)、左心室后壁舒張末期厚度(LVPWd)和室間隔舒張末期厚度(IVSd)均明顯增加。頻譜多普勒顯示:腹主動(dòng)脈縮窄處血流速度增快,壓力階差增高。彩色血流顯示:腹主動(dòng)脈縮窄處血流充盈缺損。
　　2、與Sham組大鼠相比較,TAAC組大鼠肉眼觀心臟體積明顯增大,HWI增加,室壁增厚

10、,乳頭肌和肉柱增粗。
　　3、與Sham組大鼠相比較,TAAC組大鼠HE染色示心肌細(xì)胞肥大、顏色變淡、染色不均一,大片無(wú)核區(qū),心肌纖維萎縮區(qū)域細(xì)胞核密度增加。Masson染色示內(nèi)膜下心肌纖維組織增生,血管壁增厚,血管外周大量纖維組織增生。心肌纖維表面積增大。
　　4、與Sham組比較,TAAC組大鼠心臟Beclin-1的mRNA和蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。
　　5、與Sham組比較,TAAC組大鼠心臟自噬相關(guān)蛋白LC3II/L

11、C3I表達(dá)上調(diào)、自噬泡明顯增多。
　　6、與Sham組比較,TAAC組大鼠心臟miR-30a下調(diào)。
　　小結(jié)：
　　1、心臟肥厚大鼠心臟組織自噬相關(guān)蛋白Beclin-1及自噬上調(diào)。
　　2、心臟肥厚大鼠心臟組織miR-30家族表達(dá)下調(diào)。
　　第二部分Beclin-1誘導(dǎo)的自噬在AngII引起的心肌肥厚中的作用
　　目的：
　　證實(shí)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1誘導(dǎo)的自噬在AngII引起的心肌肥厚中

12、的作用。
　　方法：
　　原代培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞,用AngII刺激心肌細(xì)胞,分別觀察自噬抑制劑3-MA、RNAiBeclin-1和過(guò)表達(dá)Beclin-1對(duì)心肌細(xì)胞肥厚基因表達(dá)的影響,并用Westernblot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3II/LC3I的表達(dá)、用流式細(xì)胞術(shù)觀察自噬率和用透射電鏡觀察心肌細(xì)胞自噬泡的變化。
　　結(jié)果：
　　1、原代心肌細(xì)胞培養(yǎng),與control組比較,AngII刺激組心肌細(xì)胞

13、自噬相關(guān)基因Beclin-1的表達(dá)明顯上調(diào)的同時(shí),肥厚基因ANP和β-MHC的表達(dá)也明顯上調(diào)。與AngII刺激組比較,3-MA+AngII組心肌細(xì)胞Beclin-1的表達(dá)明顯下調(diào)的同時(shí),肥厚基因ANP和β-MHC的表達(dá)也明顯下調(diào)。
　　2、與control組比較,AngII組心肌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3II/LC3I明顯上調(diào);與AngII組比較,AngII+3-MA組Beclin-1和LC3II/LC3I明顯下調(diào)。

14、
　　3、AngII組與control組比較,心肌細(xì)胞自噬率明顯上調(diào)。AngII+3-MA組與AngII組比較,心肌細(xì)胞自噬率明顯下調(diào)。
　　4、AngII組與control組比較,心肌細(xì)胞自噬泡明顯增多。AngII+3-MA組與AngII比較,心肌細(xì)胞自噬泡明顯減少。
　　5、與NC組比較,AngII刺激組心肌細(xì)胞Beclin-1的表達(dá)明顯上調(diào)的同時(shí),肥厚基因ANP和β-MHC的表達(dá)也明顯上調(diào)。與AngII刺激組比較

15、,Beclin-1特異性的siRNA+AngII組心肌細(xì)胞Beclin-1的表達(dá)明顯下調(diào)的同時(shí),肥厚基因ANP和β-MHC的表達(dá)也明顯下調(diào)。
　　6、AngII+NC組與NC組比較,心肌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3II/LC3I明顯上調(diào)。AngII+Beclin-1特異性的siRNA組與AngII+NC比較,Beclin-1和LC3II/LC3I明顯下調(diào)。
　　7、AngII+NC組與NC組比較,心肌細(xì)胞自噬率明

16、顯上調(diào)。AngII+Beclin-1特異性的siRNA組與AngII+NC比較,心肌細(xì)胞自噬率明顯下調(diào)。
　　8、AngII+NC組與NC組比較,心肌細(xì)胞自噬泡明顯增多。AngII+Beclin-1特異性的siRNA組與AngII+NC比較,心肌細(xì)胞自噬泡明顯減少。
　　9、過(guò)表達(dá)Beclin-1組與pRc/CMV2組比較,肥厚基因ANP和β-MHC的表達(dá)明顯上調(diào)。
　　10、過(guò)表達(dá)Beclin-1組與pRc/CMV2

17、組比較,Beclin-1和LC3II/LC3I的表達(dá)明顯上調(diào)。
　　11、過(guò)表達(dá)Beclin-1組與pRc/CMV2組比較,心肌細(xì)胞自噬率明顯上調(diào)。
　　12、過(guò)表達(dá)Beclin-1組與pRc/CMV2組比較,心肌細(xì)胞自噬泡明顯增多。
　　小結(jié)：
　　1、自噬抑制劑3-MA能抑制心肌細(xì)胞Beclin-1誘導(dǎo)的自噬,改善AngII引起的心肌肥厚基因表達(dá)。
　　2、沉默心肌細(xì)胞Beclin-1表達(dá)能抑制心肌細(xì)胞

18、Beclin-1誘導(dǎo)的自噬,改善AngII引起的心肌肥厚基因表達(dá)。
　　3、過(guò)表達(dá)Beclin-1能增強(qiáng)心肌自噬和心肌肥厚基因表達(dá)。
　　第三部分miR-30a調(diào)控的心肌自噬在AngII誘導(dǎo)的心肌肥厚中的作用
　　目的：
　　研究miR-30a是否能負(fù)調(diào)控心肌細(xì)胞Beclin-1介導(dǎo)的自噬而調(diào)控心肌肥厚。
　　方法：
　　構(gòu)建攜帶有Beclin-13’UTR的熒光素酶報(bào)告基因載體,行miR-30a過(guò)表

19、達(dá)與報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染,檢測(cè)心肌細(xì)胞熒光素酶活性的改變。通過(guò)對(duì)miR-30a過(guò)表達(dá)或者抑制miR-30a活性后,觀察心肌細(xì)胞Beclin-1mRNA與蛋白的表達(dá)變化。用Real-timePCR觀察AngII刺激后心肌細(xì)胞miR-30a的變化和肥厚基因的表達(dá),用激光共聚焦觀察AngII刺激后心肌細(xì)胞大小的變化。通過(guò)對(duì)miR-30a過(guò)表達(dá)或者抑制miR-30a活性后,觀察心肌細(xì)胞肥厚基因表達(dá)的變化及心肌自噬的變化。
　　結(jié)果：

20、　　1、轉(zhuǎn)染pGL3-Beclin-13’-UTR-WildType時(shí),與negativecontrol組比較,過(guò)表達(dá)miR-30a組熒光素酶活性下降至54.6％,抑制miR-30a活性組熒光素酶活性升高至1.32倍。
　　2、轉(zhuǎn)染pGL3-Beclin13’-UTR-Mutant時(shí),與negativecontrol組比較,過(guò)表達(dá)miR-30a組和抑制miR-30a活性組熒光素酶活性無(wú)明顯變化。
　　3、與negativec

21、ontrol組比較,過(guò)表達(dá)miR-30a組的Beclin-1mRNA表達(dá)降至42.5%,抑制miR-30a組的Beclin-1mRNA表達(dá)升高至2.25倍;與negativecontrol組比較,過(guò)表達(dá)miR-30a組的Beclin-1蛋白表達(dá)降至55.3%,抑制miR-30a組的Beclin-1蛋白表達(dá)升高至1.87倍。
　　4、與negativecontrol組比較,過(guò)表達(dá)miR-30a組的蛋白LC3II/LC3I表達(dá)下降至5

22、8.7%,抑制miR-30a組的蛋白LC3II/LC3I表達(dá)升高至1.28倍。
　　5、與AngII+NC組比較,AngII+miR-30a過(guò)表達(dá)組心肌自噬率明顯減少,與NC組比較,抑制miR-30a后心肌自噬率明顯上調(diào)。
　　6、與control組比較,miR-30ainhibitors組心肌細(xì)胞自噬泡明顯增加(0.5±0.224vs3.0±0.221,P=0.000)。與AngII刺激組比較,AngII+miR-30a過(guò)

23、表達(dá)組心肌細(xì)胞自噬泡明顯減少(2.8±0.632vs1.0±0.667,P=0.000)。
　　7、AngII刺激心肌細(xì)胞后,心肌細(xì)胞miR-30a表達(dá)量下調(diào)至刺激前的32.9%。
　　8、AngII+miR-30amimics組心肌細(xì)胞肥厚基因ANP和β-MHC表達(dá)分別是negativecontrol組的51.7%和53.5%。AngII+miR-30ainhibitors組心肌細(xì)胞肥厚基因ANP和β-MHC表達(dá)分別是An

24、gII+negativecontrol組的1.88倍和1.64倍。
　　9、激光共聚焦檢測(cè)形態(tài)學(xué)的改變,AngII刺激心肌細(xì)胞使心肌細(xì)胞面積增加至刺激前的2.95倍。與negativecontrol組比較,AngII+miR-30amimics組心肌細(xì)胞面積減少至57.8%,AngII+miR-30ainhibitors組心肌細(xì)胞面積增加至1.50倍。
　　小結(jié)：
　　1、Beclin-1是miR-30a的靶基因。

25、r>　　2、miR-30a負(fù)調(diào)控Beclin-1誘導(dǎo)的心肌自噬。
　　3、miR-30a下調(diào)可介導(dǎo)AngII誘導(dǎo)的心肌肥厚。
　　第四部分血漿miR-30a與心臟肥厚
　　目的：
　　在TAAC左室肥厚大鼠和人群中觀察血漿miR-30a與左室肥厚的關(guān)系,研究血漿miR-30a是否能作為左室肥厚患者臨床診斷的標(biāo)志物。
　　方法：
　　采用TAACSPF級(jí)Wistar大鼠制作心臟肥厚模型。動(dòng)物模型制備后4

26、周經(jīng)過(guò)超聲心動(dòng)圖證實(shí)造模成功后,中央靜脈采血獲血漿行real-timePCR法檢測(cè)rno-miR-30a的含量(sham組n=5,TAAC組n=6)。隨機(jī)入選住院患者中11例LVH(左心室肥厚)患者和11例非LVH患者。行real-timePCR法檢測(cè)血漿hsa-miR-30a的含量。用ROC曲線和Pearson相關(guān)性分析評(píng)價(jià)血漿has-miR-30a診斷心臟肥厚的價(jià)值。
　　結(jié)果：
　　1、與sham組比較,TAAC組大鼠

27、血漿rno-miR-30a升高,TAAC組鼠血漿rno-miR-30a水平是Sham組的4.23倍。
　　2、LVH組患者血漿miR-30a水平是非LVH組的2.07倍。
　　3、患者血漿miR-30a水平的AUC(曲線下面積)為0.760。血漿has-miR-30a水平用于診斷LVH有意義。
　　4、確定has-miR-30a判斷心臟肥厚的最佳臨界點(diǎn)為7.049(2-Δct*104),此時(shí),敏感度和特異度均為81.8

28、%。
　　5、Pearson相關(guān)性分析表明,患者血漿has-miR-30a水平與IVSd和LVPWd均正相關(guān)(R值分別為0.466和0.480,P值分別為0.029和0.024)。
　　小結(jié)：
　　1、心臟肥厚大鼠血漿miR-30a升高
　　2、LVH患者血漿miR-30a升高
　　3、血漿has-miR-30a水平與IVSd和LVPWd呈正相關(guān),血漿has-miR-30a水平用于診斷LVH有意義。