心臟發(fā)育相關(guān)基因Pax-8的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究胚胎發(fā)育不同時(shí)間心臟特異性骨形態(tài)形成蛋白受體IA(BMPR1A，又名ALK3)基因敲除小鼠心肌組織中的Pax-8的mRNA表達(dá)水平，并構(gòu)建含大鼠Pax-8基因全長(zhǎng)序列的真核表達(dá)載體pcDNA3.1_Pax-8，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞系H9C2細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，測(cè)定轉(zhuǎn)染后Pax-8基因?qū)π募〖?xì)胞增殖及凋亡的影響。
　　 方法：雌的α-MHCCre+/-，ALK+/-和雄的ALK3F/F（在ALK3基因第二外顯子兩邊插入

2、LoxP的片段）交配，以胎膜及胎體PCR鑒定為ALK3基因敲除純合子小鼠(α-MHCCre+/-、ALK3F/-)胚胎心臟為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組為相同胎齡C57/B6小鼠；時(shí)間點(diǎn)取胚胎9.5天(E9.5d)、E10.5d、E11.5d、E12.5d、E13.5d、E15.5d、E17.5d及出生后第一天(P0)，均提取胚胎心臟總RNA，熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)兩組小鼠胚胎發(fā)育各階段心臟Pax-8基因mRNA的表達(dá)水平。
　　 KpnI

3、、NotI雙酶切pCMVsport6_Pax-8質(zhì)粒獲得大鼠Pax-8全長(zhǎng)基因.通過(guò)基因重組技術(shù)將其插入到具有相同粘性末端的真核表達(dá)載體pcDNA3.1中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1_Pax-8。質(zhì)粒聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction，PCR)、限制性酶切鑒定和DNA測(cè)序鑒定插入片段確實(shí)為Pax8基因。將重組質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至大鼠心肌細(xì)胞系H9C2細(xì)胞中，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscrip

4、t-polymerasechainreaction,RT-PCR)及Westernblot法分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Pax-8信使RNA(messageRNA，mRNA)及蛋白表達(dá)水平，CCK8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖能力。以不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)心肌細(xì)胞48h，造成血清饑餓誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡模型，同時(shí)進(jìn)行Pax-8質(zhì)粒及相同量空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，分組：①正常細(xì)胞組；②陰性對(duì)照組：轉(zhuǎn)染相同量空質(zhì)粒的正常細(xì)胞組；③轉(zhuǎn)染重組Pax-8質(zhì)粒的心肌細(xì)胞凋亡模

5、型；④轉(zhuǎn)染相同量空質(zhì)粒的心肌細(xì)胞凋亡模型。轉(zhuǎn)染后48h，進(jìn)行AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PropidiumIodide，PI)染色。流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，AnnexinV單陽(yáng)性為早期凋亡細(xì)胞。提取以上各組細(xì)胞蛋白，Westernblot法檢測(cè)細(xì)胞凋亡蛋白酶（Caspase3）的表達(dá)，評(píng)估細(xì)胞凋亡情況。
　　 結(jié)果：熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示：C57胚胎小鼠9.5、10.5、11.5、12.5、13.5、15.5、17.5

6、d的Pax-8基因的表達(dá)水平以10.5d表達(dá)最高，隨后迅速下降至出生后表達(dá)最低；ALK3基因敲除純合子胚胎小鼠心臟Pax-8基因的表達(dá)高峰則出現(xiàn)在胚胎發(fā)育的第12.5d，且較對(duì)照組的峰值顯著降低(P＜0.05)，至胚胎第13.5天以后純合子小鼠死亡。
　　 而通過(guò)酶切、重組的pcDNA3.1_Pax-8真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞后證實(shí)Pax-8基因mRNA及蛋白表達(dá)均明顯高于空白對(duì)照組(P＜0.05)及空質(zhì)粒組(P＜0.05)。轉(zhuǎn)

7、染Pax-8基因能提高心肌細(xì)胞的增殖能力(P＜0.05)，AnnexinV-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率表明，Pax-8基因能明顯抑制血清饑餓引起的細(xì)胞凋亡(P＜0.01)，Westernblot法顯示Pax-8基因降低activatedCaspase3的表達(dá)(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：心臟特異性ALK3基因敲除后Pax-8基因表達(dá)高峰的右移、表達(dá)量下調(diào)，提示Pax-8基因在胚胎發(fā)育中不同時(shí)間的表達(dá)變化可能與小鼠心