小鼠心臟Pax-8剪接體的克隆及其時(shí)空表達(dá)研究.pdf

1、目的:轉(zhuǎn)錄因子Pax-8(paired box gene8)屬于成對(duì)盒基因家族一員，該家族共有9個(gè)成員，分別命名為Pax-1至Pax-9，該家族的編碼產(chǎn)物在胚胎發(fā)育及腫瘤發(fā)生中具有重要作用。據(jù)報(bào)道，Pax-8基因在人來(lái)源的細(xì)胞系中，因外顯子7或外顯子8的存在或缺失，存在四種不同的剪接體。在人胚胎胎盤中，發(fā)現(xiàn)Pax-8存在另兩種不同剪接體。研究發(fā)現(xiàn)，pax8可調(diào)控Wnt4的表達(dá)，Wnt4表達(dá)下調(diào)與上皮間質(zhì)化相關(guān)，而心肌梗死后心室重構(gòu)過(guò)程和

2、內(nèi)皮間質(zhì)化相關(guān)，Pax-8是否與心室重構(gòu)過(guò)程相關(guān)尚無(wú)報(bào)道。本研究旨在克隆及鑒定小鼠心臟Pax-8基因亞型，檢測(cè)其在發(fā)育階段的時(shí)空表達(dá)及在心肌梗死過(guò)程中的表達(dá)，為進(jìn)一步研究pax8不同亞型在心臟發(fā)育及心肌梗死中的功能研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法:成年野生型雌雄C57BL/6小鼠各10只配籠，每日檢查雌鼠陰道栓，記錄懷孕時(shí)間。在雌鼠不同懷孕時(shí)間，即胚胎不同發(fā)育時(shí)間段，頸脫臼法處死孕鼠，取胚胎分離胎心。處死出生12小時(shí)乳鼠，分離心臟。Tri

3、zol法提取胎心總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，應(yīng)用Q5超保真酶擴(kuò)增pax8基因閱讀編碼框，并克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1（-），使用BspEⅠ和BamHⅠ雙酶切進(jìn)行酶切鑒定，同時(shí)進(jìn)行測(cè)序鑒定。測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞系，實(shí)驗(yàn)分為五個(gè)組:1、空白pcDNA3.1（-）轉(zhuǎn)染組;2、Pax-8a-pcDNA3.1（-）轉(zhuǎn)染組;3、Pax-8b-pcDNA3.1（-）轉(zhuǎn)染組;4、Pax-8c-pcDNA3.1（-）轉(zhuǎn)染組;5、Pa

4、x-8d-pcDNA3.1（-）轉(zhuǎn)染組，使用lipofectamin2000轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，q-PCR法檢測(cè)pax8在mRNA水平表達(dá)。選取同窩四月齡雄性小鼠4只，行冠狀動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)，術(shù)后半小時(shí)處死，分別提取梗死區(qū)和非梗死區(qū)心肌組織蛋白，WB檢測(cè)Pax-8表達(dá)水平。
　　結(jié)果:在小鼠胚胎發(fā)育不同時(shí)期，除已知全長(zhǎng)Pax-8a(1374bp)外，發(fā)現(xiàn)三個(gè)新的小鼠Pax-8選擇性剪接體，分別命名為P

5、ax-8b（1176bp，第4外顯子缺失）、Pax-8c（1079bp，第4和第11外顯子缺失）、Pax-8d（969bp，第4和第9外顯子缺失），在不同的發(fā)育時(shí)期出現(xiàn)的Pax-8剪接體不同。成功構(gòu)建了小鼠Pax-8a-pcDNA3.1（-）、Pax-8b-pcDNA3.1（-）、Pax-8c-pcDNA3.1（-）、Pax-8d-pcDNA3.1（-）四個(gè)重組真核表達(dá)載體，重組載體轉(zhuǎn)染至H9c2心肌細(xì)胞后，q-PCR顯示四組重組載體轉(zhuǎn)

6、染組相對(duì)空白pcDNA3.1（-）轉(zhuǎn)染組，Pax-8表達(dá)水平明顯上升。小鼠冠狀動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后，梗死區(qū)Pax-8蛋白表達(dá)水平較非梗死區(qū)顯著上升。
　　結(jié)論:小鼠心臟中Pax-8存在三種選擇性剪接體，且在不同發(fā)育時(shí)期差異表達(dá)，此發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步的功能研究打下基礎(chǔ)。通過(guò)基因重組技術(shù)，成功擴(kuò)增Pax-8不同亞型，并克隆至真核表達(dá)載體，構(gòu)建Pax-8a-pcDNA3.1（-）、Pax-8b-pcDNA3.1（-）、Pax-8c-pcDNA3.1（