家蠶BmYki不同剪接體的功能研究.pdf

1、Hippo Pathway是一類重要的調(diào)節(jié)器官生長(zhǎng)的信號(hào)通路。在Hippo信號(hào)通路中，其核心就是由一系列的磷酸化的成分組成：絲氨酸/蘇氨酸Ste20家族激酶Hpo;核Dbf-2相關(guān)（NDR）家族激酶Warts(Wts),以及兩種相互作用的支架蛋白Sav和作為腫瘤抑制基因(Mats)的Mob。當(dāng)其中任何一個(gè)成員發(fā)生突變時(shí)，都會(huì)造成細(xì)胞的生長(zhǎng)異常。例如：在成蟲的發(fā)育過(guò)程中，Wts的突變?cè)诙鄠€(gè)器官和組織的發(fā)育過(guò)程中能夠引起劇烈的細(xì)胞增殖。Yo

2、rkie，作為存在于在Hippo Pathway信號(hào)通路中最核心的含有WW結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄共激活因子，是該信號(hào)通路中一個(gè)激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)最重要的下游元件，即Hop-Sav復(fù)合物磷酸化并激活Wts-Mats復(fù)合物的下游元件。激活后的Wts-Mats復(fù)合物導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄輔助激活因子Yorkie(Yki)發(fā)生磷酸化與細(xì)胞質(zhì)中的14-3-3蛋白結(jié)合，從而失活并滯留在細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)Hippo Pathway信號(hào)通路發(fā)生抑制時(shí)，Yki的抑制作用就會(huì)消失，進(jìn)入細(xì)胞核

3、中，與轉(zhuǎn)錄因子Sd結(jié)合,通過(guò)調(diào)節(jié)Hippo Pathway的目的基因包括diap1，cyclinE和Bantam來(lái)引起細(xì)胞的增殖以及抑制細(xì)胞凋亡等過(guò)程。
　　1.家蠶Yki基因不同剪接體及突變體轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選與鑒定
　　為了研究家蠶Hippo信號(hào)通路中的關(guān)鍵輔助轉(zhuǎn)錄因子BmYki不同剪接體的功能，需要獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。通過(guò)獲得重組質(zhì)粒pIZT-V5/His-BmYki2和pIZT-V5/His-BmYki3，將獲得的重

4、組質(zhì)粒和錢瑩先前構(gòu)建好的pIZT-V5/His-BmYki1和pIZT-V5/His-BmYki1S97A以及本實(shí)驗(yàn)室保存好的空載pIZT-V5/His載體轉(zhuǎn)染進(jìn)家蠶BmN細(xì)胞中。細(xì)胞定位結(jié)果顯示：BmYki1，BmYki2，BmYki3及和BmYki1S97A蛋白在家蠶BmN培養(yǎng)細(xì)胞中能夠表達(dá)，且BmYki1主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，BmYki2主要分布于細(xì)胞核中，BmYki3主要分布于細(xì)胞核中，磷酸化位點(diǎn)突變后的BmYki1S97A在細(xì)胞

5、核中也能檢測(cè)到，表明BmYki1磷酸化對(duì)于該蛋白的表達(dá)位置起著重要作用，空白對(duì)照組顯示Yki基因主要分布于細(xì)胞質(zhì)中。從而進(jìn)一步說(shuō)明在Hippo信號(hào)通路中，BmYki2和BmYki3對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)起著正調(diào)控的作用。
　　2.過(guò)表達(dá)BmYki1，BmYki2，BmYki3及BmYki1S97A對(duì)細(xì)胞及家蠶翅原基的影響
　　為了探討B(tài)mYki基因不同剪接亞型的功能，本章研究主要在兩方面進(jìn)行：細(xì)胞和翅原基。
　　當(dāng)不同剪接亞型基

6、因在細(xì)胞上過(guò)表達(dá)時(shí)，細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖、細(xì)胞大小和細(xì)胞周期均發(fā)生了不同的變化。結(jié)果顯示：在0 h-78 h，過(guò)表達(dá)BmYki1，BmYki2，BmYki3，BmYki1S97A及pIZT-V5/His載體的BmN細(xì)胞及野生型細(xì)胞分別遷移了1294.96μm，1097.62μm，1327.60μm，1098.87μm，633.59μm，1027.00μm，而其中過(guò)表達(dá)BmYki3的細(xì)胞相比較野生型細(xì)胞及其他轉(zhuǎn)基因細(xì)胞而言在相同的時(shí)間內(nèi)遷移

7、距離最大。pIZT-V5/His-BmYki1-BmN細(xì)胞和pIZT-V5/His-BmYki3-BmN細(xì)胞分裂速度高于野生型BmN細(xì)胞；pIZT-V5/His-BmYki2-BmN細(xì)胞，pIZT-V5/His-BmYki1S97A-BmN細(xì)胞和pIZT-V5/His-BmN細(xì)胞分裂速度低于野生型BmN細(xì)胞。其中p IZT-V5/His-BmYki3-BmN細(xì)胞分裂速度最高，pIZT-V5/His-BmYki1S97A-BmN細(xì)胞分裂速

8、度最慢。細(xì)胞大小隨著時(shí)間的增長(zhǎng)在逐步增加，BmN細(xì)胞，pIZT-V5/His-Bm Yki1-BmN細(xì)胞，pIZT-V5/His-BmYki2-BmN細(xì)胞，pIZT-V5/His-BmYki3-BmN細(xì)胞分別在第3天，第3、5天，第3、6天，第2、5天時(shí)，細(xì)胞又突然變小，可能由于細(xì)胞開始新一輪的增殖分化。在細(xì)胞周期方面，pIZT-V5/His-BmYki1-BmN細(xì)胞、pIZT-V5/His-BmYki2-BmN細(xì)胞、pIZT-V5/H

9、is-BmYki3-BmN細(xì)胞的S期/G2期普遍比對(duì)照組細(xì)胞高，而突變體轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的S期/G2期和對(duì)照組細(xì)胞相近。過(guò)表達(dá)B mYki1基因后，kibra、iap、fj和ex基因的表達(dá)量較pIZT-BmN細(xì)胞有顯著增加；過(guò)表達(dá)BmYki2基因后，wnt、kibra、iap、fj、ex和bmpr基因較pIZT-BmN細(xì)胞有顯著增加；過(guò)表達(dá)BmYki3基因后，wnt、kibra、iap、fj、ex和bmpr基因均有顯著上調(diào)；過(guò)表達(dá)BmYki1

10、S97A基因后，wnt、kibra、fj、ex、crb和bmpr基因表達(dá)量較p IZT-BmN細(xì)胞有所提高。cat、dpp、serr和stat基因在pIZT-V5/His-BmN、轉(zhuǎn)Bm Yki1，BmYki2，BmYki3和BmYki1S97A的細(xì)胞系中的表達(dá)水平均下調(diào)。
　　在翅膀過(guò)表達(dá)后，過(guò)表達(dá)BmYki1基因，BmYki2基因和BmYki3基因時(shí)，蠶蛾右翅發(fā)育異常的比例分別有30％、40%和30%；而只注射ddH2O的對(duì)照

11、組的蠶蛾翅膀均正常發(fā)育。前翅擴(kuò)大比率普遍比后翅擴(kuò)大比率大。當(dāng)翅膀過(guò)表達(dá)BmYki1時(shí)，myc、ex、kibra、wts2、iap、fj、bmpr、wnt和dpp基因均有所下降，cat、cycE和stat基因上調(diào)；當(dāng)過(guò)表達(dá)BmYki2時(shí)，myc、ex、kibra、wts2、iap、fj、bmpr、wnt和dpp基因均有所下降，cat和cycE基因上調(diào)；當(dāng)過(guò)表達(dá)BmYki3時(shí)，myc、ex、kibra、fj和dpp基因均有所下降，cat、c

12、ycE、crb和wts2基因上調(diào)。
　　3.過(guò)表達(dá)BmYki3家蠶細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的比較研究
　　為了更加全面了解過(guò)表達(dá)BmYki3后，家蠶BmN細(xì)胞內(nèi)部基因發(fā)生的變化，通過(guò)應(yīng)用RNA-Seq技術(shù)獲得轉(zhuǎn)錄組信息。分析結(jié)果顯示：，在家蠶BmN細(xì)胞與過(guò)表達(dá)BmYki3細(xì)胞比較中，其中上調(diào)基因的數(shù)量有10291個(gè)，下調(diào)基因的數(shù)量有4444個(gè)。GO(Ontology)富集分析顯示：差異表達(dá)基因有49個(gè)GO分類，分別在細(xì)胞組件、分子功能和生

13、物進(jìn)程三個(gè)大類中。KEGG富集分析顯示，與家蠶細(xì)胞增殖、分化、凋亡、大小相關(guān)的MAPK、Wnt、Hippo、JAK-STAT、mTOR等信號(hào)通路均有富集，且有基因富集多個(gè)信號(hào)通路中，將多條信號(hào)通路聯(lián)系在一起，共同發(fā)揮調(diào)控作用。
　　在家蠶Hippo信號(hào)通路中，剪接體BmYki1、BmYki2和BmYki3功能有所不同，其中BmYki1起次要的正調(diào)控作用，BmYki2起微調(diào)及平衡調(diào)節(jié)作用，BmYki3起著主要正調(diào)控作用。當(dāng)過(guò)表達(dá)Bm

14、Yki1時(shí)，會(huì)促進(jìn)BmYki3的表達(dá)，主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞增殖速度變快，細(xì)胞分裂數(shù)增加，細(xì)胞遷移速率變快，細(xì)胞體積增大；當(dāng)過(guò)表達(dá)BmYki2時(shí)，并不會(huì)促進(jìn)BmYki3的表達(dá)，反而使BmYki3的表達(dá)量有微弱下調(diào)，由于缺少一個(gè)WW結(jié)構(gòu)域，主要定位在細(xì)胞核中，細(xì)胞質(zhì)中也存在，細(xì)胞的增殖速度沒(méi)有明顯變快，細(xì)胞分裂數(shù)沒(méi)有明顯增加，細(xì)胞遷移速率么有明顯加快；當(dāng)過(guò)表達(dá)BmYki3時(shí)，會(huì)促進(jìn)BmYki1的表達(dá)，但是BmYki3的表達(dá)量沒(méi)有明顯增加