TRAF3及其剪接體TRAF3-S調(diào)控鴨的抗病毒天然免疫反應(yīng)的分子機(jī)制研究.pdf

1、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3（TNF receptor associated factor3，TRAF3）作為連接上下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的一個(gè)中轉(zhuǎn)分子，在細(xì)胞內(nèi)具有多樣化的功能。已有研究表明TRAF3負(fù)調(diào)控MAPK信號(hào)通路和非經(jīng)典的NF-κB信號(hào)通路，但是正調(diào)控I型干擾素信號(hào)通路。I型干擾素的產(chǎn)生依賴于細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)的病原模式識(shí)別受體（PRRs）對(duì)病原相關(guān)分子模式（PAMPs）的識(shí)別。其中Toll樣蛋白受體(TLRs)和RIG-I樣解旋酶受體(

2、RLRs)是最主要的兩類模式識(shí)別受體。TRAF3在TLRs介導(dǎo)的和RLRs介導(dǎo)的I型干擾素信號(hào)通路中發(fā)揮著重要的作用。在TLRs介導(dǎo)的I型干擾素信號(hào)通路中，TRAF3通過與上游信號(hào)分子TRIF相互作用（TLR3和TLR4），將激活信號(hào)傳遞給下游信號(hào)分子激活I(lǐng)型干擾素的產(chǎn)生；在RLRs介導(dǎo)的I型干擾素信號(hào)通路中，TRAF3與上游信號(hào)蛋白MAVS相互作用，將激活信號(hào)傳遞給下游信號(hào)分子誘導(dǎo)I型干擾素產(chǎn)生。TRAF3在哺乳動(dòng)物天然免疫反應(yīng)中扮演

3、的重要角色已經(jīng)被研究的比較清楚，而鴨TRAF3在鴨天然免疫信號(hào)通路中是否也具有同樣重要的功能，目前未見有報(bào)導(dǎo)。
　　在本研究中，我們克隆鑒定得到鴨的全長TRAF3基因（duTRAF3）及其可變剪接體（duTRAF3-S），利用qRT-PCR分析duTRAF3和duTRAF3-S在健康鴨組織及Poly（I：C）刺激條件下的表達(dá)變化。我們的研究工作發(fā)現(xiàn)duTRAF3正調(diào)控IFN-β信號(hào)通路，而duTRAF3-S負(fù)調(diào)控IFN-β信號(hào)通路

4、，并且對(duì)duTRAF3和duTRAF3-S調(diào)控IFN-β信號(hào)通路的機(jī)制進(jìn)行了詳細(xì)的研究，發(fā)現(xiàn)了剪接體蛋白調(diào)節(jié)信號(hào)通路的一種新機(jī)制，即duTRAF3-S可以通過與野生型duTRAF3相互作用，改變野生型duTRAF3同源三聚體的結(jié)構(gòu)，從而負(fù)調(diào)控IFN-β信號(hào)通路。主要研究內(nèi)容如下：
　　1.duTRAF3促進(jìn)IFN-β產(chǎn)生，duTRAF3-S抑制IFN-β產(chǎn)生
　　首先克隆獲得野生型 duTRAF3基因的cDNA序列及其剪接體

5、duTRAF3-S的cDNA序列，提交GenBank，并構(gòu)建了它們的表達(dá)載體。在Poly（I：C）處理的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，利用qRT-PCR檢測了duTRAF3、duTRAF3-S和IFN-β基因的轉(zhuǎn)錄水平變化，發(fā)現(xiàn)duTRAF3可能上調(diào)IFN-β的表達(dá)，而duTRAF3-S可能下調(diào)IFN-β的表達(dá)。通過雙熒光報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和VSV-GFP檢測系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)duTRAF3確實(shí)正調(diào)控IFN-β的產(chǎn)生，而過表達(dá)duTRAF3-S抑制IFN-β的產(chǎn)

6、生。
　　2.duTRAF3與duMAVS和duTRIF相互作用，而duTRAF3-S則不能
　　免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明, duTRAF3通過TRAF結(jié)構(gòu)域與duMAVS或duTRIF相互作用，分別激活RLRs介導(dǎo)的或TLRs介導(dǎo)的IFN-β信號(hào)通路；而duTRAF3-S不能與duMVAS或duTRIF相互作用，說明剪接體duTRAF3-S與duTRAF3比較，存在功能障礙。
　　3.duTRAF3-S的N末端與C末端發(fā)生

7、折疊
　　duTRAF3-S含有TRAF結(jié)構(gòu)域，卻不能與duMAVS或duTRIF相互作用，我們猜測duTRAF3-S的N末端將C末端的TRAF結(jié)構(gòu)域包裹。通過熒光素酶片段互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明了duTRAF3-S的N末端與C末端發(fā)生分子內(nèi)相互作用，即duTRAF3-S的兩端發(fā)生折疊。
　　4.duTRAF3-S抑制duTRAF3-duMAVS/duTRIF復(fù)合物形成
　　我們通過構(gòu)建不同的duTRAF3截短體，并通過免疫共沉淀

8、實(shí)驗(yàn)證明coil3結(jié)構(gòu)域是duTRAF3形成聚合物必需的，并且duTRAF3形成同源聚合物對(duì)于duTRAF3與duMAVS和duTRIF的相互作用至關(guān)重要。duTRAF3-S含有coil3結(jié)構(gòu)域，通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)duTRAF3-S能夠與duTRAF3相互作用，形成異源聚合物，抑制duTRAF3同源聚合物的形成，從而抑制duTRAF3-duMAVS/duTRIF復(fù)合物形成，最終使IFN-β產(chǎn)生受到抑制。
　　5.duTRAF

9、3抑制H5N1/HM病毒和DTMUV病毒復(fù)制，duTRAF3-S促進(jìn)H5N1/HM病毒和DTMUV病毒復(fù)制
　　通過在 DEFs細(xì)胞中過表達(dá) duTRAF3或 duTRAF3-S后感染H5N1/HM病毒或DTMUV病毒，發(fā)現(xiàn)duTRAF3抑制H5N1/HM病毒和DTMUV病毒復(fù)制，而duTRAF3-S促進(jìn)H5N1/HM病毒和DTMUV病毒復(fù)制，與duTRAF3正調(diào)控IFN-β信號(hào)通路和duTRAF3-S負(fù)調(diào)控IFN-β信號(hào)通路是一