雞MDA5-STING-IFN-β抗病毒天然免疫通路的發(fā)現(xiàn)及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制.pdf

1、天然免疫在機體抗病毒感染中發(fā)揮十分重要的作用。病毒感染宿主細胞后，宿主細胞通過模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)識別病原相關(guān)分子模式(pathogen-assoeiated molecular patterns，PAMP)，進而通過一系列級聯(lián)免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)干擾素(IFN)和促炎癥細胞因子等抗病毒分子產(chǎn)生，發(fā)揮抗病毒作用。RIG-I樣受體（retinoic acid-inducible gen

2、e-I-like receptor，RLR）是一類胞質(zhì)內(nèi)的PRR，哺乳動物 RLR包括三個成員：RIG-I、MDA5（mammalian melanoma differentiation associated gene5）和LGP2（laboratory of genetics and physiology2），其中，RIG-I在 RNA病毒識別及抗病毒感染過程中的作用尤為重要。雖然鴨、鵝、鴿子等禽類都具有RIG-I基因，但是雞細胞中R

3、IG-I基因天然缺失。
　　STING（stimulator of interferon genes）是新發(fā)現(xiàn)的另一個重要的天然免疫樞紐分子，哺乳動物的STING通過 RIG-I識別 RNA病毒并基于RIG-I-STING-IRF3-IFN-β信號傳導(dǎo)軸誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生。對雞基因組分析發(fā)現(xiàn)，雞有一個疑似STING（chSTING）基因，那么chSTING能否參與RNA病毒識別和干擾素誘導(dǎo)？雖然哺乳動物STING并未出現(xiàn)在MDA5

4、介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素信號通路中，那么在RIG-I天然缺失的雞細胞中，同為RNA模式識別受體的chMDA5是否會與chSTING建立聯(lián)系、形成新的信號通路？據(jù)此，本文聚焦chSTING基因，研究其在Ⅰ型干擾素誘導(dǎo)及抗RNA病毒中的作用，揭示其發(fā)揮功能的分子基礎(chǔ)，探究其不同于哺乳動物的Ⅰ型干擾素天然免疫通路及信號傳導(dǎo)機制。
　　本文首先克隆了可能涉及 chMDA5通路的免疫分子 chMDA5、chMAVS和chIRF7，通過基因過表達和

5、RNA干擾介導(dǎo)的基因下調(diào)實驗，發(fā)現(xiàn) chMDA5、chMAVS和 chIRF7均為干擾素誘導(dǎo)相關(guān)基因，其在雞細胞的干擾素誘導(dǎo)和抗H9N2禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）中發(fā)揮重要作用，為系統(tǒng)研究chMDA5介導(dǎo)的信號通路及揭示其與chSTNG的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。
　　為了確定chSTING在RIG-I缺失的雞細胞中的功能，本文克隆了chSTING基因，序列分析發(fā)現(xiàn)chSTING與人STING各功能域相

6、似度低，同源性僅為43.3%。組織分布分析發(fā)現(xiàn) chSTING在雞所有組織器官中均能表達，但在免疫器官中分布最豐富。亞細胞定位顯示 chSTING在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體上均有定位，但其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上定位更占優(yōu)勢。通過基因過表達和RNA干擾實驗發(fā)現(xiàn)，chSTING能夠強烈誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生。同時，抗病毒研究發(fā)現(xiàn)chSTING在抗RNA和DNA病毒中均發(fā)揮重要作用。表明雞具有STING基因，并且chSTING參與了Ⅰ型干擾素誘導(dǎo)及抗病毒免疫。

7、　　為了揭示chSTING介導(dǎo)信號傳導(dǎo)的分子基礎(chǔ)，通過功能域刪除和定點突變，進一步研究了chSTING的活性功能域和關(guān)鍵氨基酸位點。功能域刪除研究發(fā)現(xiàn)，chSTING的4個跨膜區(qū)（transmembrane domain，TM）對其功能的發(fā)揮十分重要，每個跨膜區(qū)的刪除都顯著降低了 chSTING的干擾素誘導(dǎo)作用，且其 C端的28個氨基酸的刪除可導(dǎo)致chSTING功能完全喪失，提示該區(qū)域包含chSTING發(fā)揮功能至關(guān)重要的功能域或氨基酸位

8、點。定點突變研究結(jié)果表明，chSTING的信號傳導(dǎo)可能涉及蛋白磷酸化和泛素化修飾等調(diào)控機制，并發(fā)現(xiàn)chSTING的S366位點對其功能極其重要，S366A突變可導(dǎo)致chSTING功能完全喪失。
　　雖然在哺乳動物細胞中，STING只參與了RIG-I通路而未出現(xiàn)在MDA5通路中，但是，由于雞RIG-I天然缺失且本研究發(fā)現(xiàn)chSTING具有抗RNA病毒的作用，因此推測chSTING可能與雞最重要RNA模式識別受體chMDA5具有密切聯(lián)

9、系。通過研究發(fā)現(xiàn)，RNA干擾介導(dǎo)chSTNG表達下調(diào)可顯著抑制poly（I:C）和chMDA5過表達對IFN-β的激活，提示chSTING可能參與到chMDA5信號通路中。同時，免疫共沉淀（Co-IP）結(jié)果顯示，chSTING能夠與chMDA5發(fā)生相互作用，并且chMAVS的存在能夠增強chMDA5和chSTING的相互作用，表明chSTING能夠參與到chMDA5介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素信號通路中。進一步研究發(fā)現(xiàn)，chMDA5的CARD區(qū)、C

10、ARD+DEXD區(qū)、chMDA5全長均能與chSTING發(fā)生互作并激活 IFN-β通路，缺失了 CARD區(qū)的chMDA5雖然能夠與 chSTING發(fā)生互作，但不能激活 IFN-β通路。表明 chSTING通過與 chMDA5的CARD區(qū)互作參與到了chMDA5通路中并激活I(lǐng)FN-β。
　　哺乳動物STING通過IRF3激活I(lǐng)FN-β，然而雞IRF3也天然缺失，為了確定chSTING激活I(lǐng)FN-β所依賴的轉(zhuǎn)錄因子，通過軟件分析發(fā)現(xiàn)雞

11、IFN-β啟動子上有3個IRF順式作用元件。通過chSTING過表達、chIRF7過表達、chSTNG下調(diào)表達對 IRF順式作用元件報告基因和 IFN-β啟動子的激活情況研究，確定chSTING通過chIRF7激活I(lǐng)FN-β。
　　為了確定chSTING在chMDA5介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素信號通路中的具體位置，本文進一步通過多基因過表達和RNA干擾矩陣實驗，并結(jié)合蛋白互作結(jié)果，確定了一條由chMDA5介導(dǎo)、以chSTING為核心的chM

12、DA5-chMAVS-chSTING-chIRF7-IFN-βⅠ型干擾素信號傳導(dǎo)軸。
　　綜合以上研究結(jié)果，本文在RIG-I和 IRF3基因天然缺失的雞細胞中發(fā)現(xiàn)了一條不同于哺乳動物的chMDA5-chMAVS-chSTING-chIRF7-IFN-β天然免疫信號通路，在這條通路中，chSTING通過chMAVS接收chMDA5傳遞的病原識別信號，進而通過下游的chIRF7激活I(lǐng)FN-β，發(fā)揮抗病毒作用。該通路的發(fā)現(xiàn)不僅更新了MD