TRIM65在MDA-5抗病毒信號(hào)活化過程中的關(guān)鍵作用及其機(jī)制探究.pdf

1、天然免疫抗病毒信號(hào)活化是機(jī)體免疫系統(tǒng)抵抗外界病毒感染的第一道防線，而RIG-Ⅰ樣模式識(shí)別受體所調(diào)控的抗病毒信號(hào)活化是天然免疫抗病毒系統(tǒng)中非常重要的一個(gè)組成部分。RIG-Ⅰ樣模式識(shí)別受體能夠特異性地感知RNA病毒的入侵，活化下游信號(hào)通路，誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素及其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生，誘發(fā)機(jī)體對(duì)病毒實(shí)施有效的抵抗。RIG-Ⅰ樣模式識(shí)別受體家族主要有三個(gè)成員，分別是RIG-Ⅰ、MDA-5以及LGP2。其中RIG-Ⅰ和MDA-5分別能夠特異性地識(shí)別不同種

2、類的RNA病毒，而LGP2主要是針對(duì)RIG-Ⅰ和MDA-5的活化過程起到調(diào)控作用。RIG-Ⅰ或MDA-5功能的缺失會(huì)使得機(jī)體不能夠有效抵抗RNA病毒的感染，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)多種病癥甚至死亡。而二者功能的過度活化同樣會(huì)導(dǎo)致機(jī)體穩(wěn)態(tài)的失衡，出現(xiàn)一系列自身免疫性疾病，如紅斑狼瘡?？梢奟IG-Ⅰ和MDA-5功能的正常發(fā)揮對(duì)于機(jī)體抵抗RNA病毒以及穩(wěn)態(tài)的維持是不可或缺的。目前，對(duì)于RIG-Ⅰ信號(hào)活化機(jī)制的探究相對(duì)較為清楚，但是對(duì)于MDA-5是如何被活

3、化的目前的研究還知之甚少。目前已知MDA-5與RIG-Ⅰ相似也會(huì)被PP1介導(dǎo)發(fā)生磷酸化修飾，而其他修飾類型是否在其中也起著重要的作用目前仍是未知的。尤其是在RIG-Ⅰ的活化過程中起著關(guān)鍵作用的泛素化修飾，是否在MDA-5活化過程中也起著至關(guān)重要的作用，以及有哪些泛素連接酶參與到其中目前還不清楚。基于以上原因，本文以前人的研究為基礎(chǔ)，針對(duì)RNA活化MDA-5的分子機(jī)制展開了一系列探討。
　　在本文的研究中，我們利用免疫共沉淀及質(zhì)譜分

4、析的方法篩選到與MDA-5可能存在相互作用的蛋白。在眾多篩選到的蛋白中，我們發(fā)現(xiàn)，一種E3泛素連接酶—TRIM65，與MDA-5存在著非常強(qiáng)的相互作用。后續(xù)的一系列實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一相互作用的存在。為了探究二者的相互作用對(duì)于MDA-5信號(hào)活化的作用，我們構(gòu)建了Trim65缺陷小鼠，并利用MDA-5信號(hào)特異性活化劑處理缺陷鼠以及缺陷鼠來源的細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TRIM65表達(dá)缺失后，MDA-5抗病毒信號(hào)通路的活化受到了極大程度的抑制。在人源細(xì)胞

5、中我們也得到了類似的結(jié)果。機(jī)制方面，我們發(fā)現(xiàn)TRIM65能夠利用其自身的E3泛素連接酶的活性誘導(dǎo)MDA-5的743位賴氨酸發(fā)生K63連接方式的泛素化。進(jìn)一步我們利用SDD-AGE以及激光共聚焦技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了TRIM65對(duì)MDA-5泛素化的誘導(dǎo)能夠顯著促進(jìn)MDA-5寡聚體的形成，而MDA-5寡聚體的形成是MDA-5抗病毒信號(hào)活化的關(guān)鍵步驟。
　　通過以上研究，我們不僅發(fā)現(xiàn)了TRIM65是MDA-5信號(hào)活化過程中的一個(gè)關(guān)鍵組分，同時(shí)還證