Kupffer細(xì)胞中TRAF3調(diào)控MAPK及TRIF信號(hào)通路誘導(dǎo)內(nèi)毒素耐受的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分: Kupffer細(xì)胞內(nèi)毒素耐受時(shí)TRAF3基因、蛋白表達(dá)及K-48泛素化水平變化
　　目的:觀察內(nèi)毒素耐受時(shí)，Kupffer細(xì)胞(KCs)內(nèi)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3(TRAF3)基因及蛋白表達(dá)變化，K-48泛素化水平以及下游細(xì)胞因子的分泌情況。方法:采用離體膠原酶消化、密度梯度離心聯(lián)合選擇性貼壁法分離KCs，F(xiàn)4/80免疫熒光染色鑒定KCs的純度，臺(tái)盼藍(lán)拒染及吞墨實(shí)驗(yàn)判斷KCs的活性及吞噬功能，光鏡下動(dòng)態(tài)觀察KCs隨時(shí)

2、間的形態(tài)變化。將分離、培養(yǎng)的KCs以3-4×106密度接種于六孔板中，并隨機(jī)分為2組:①內(nèi)毒素耐受組(ETT Group):給予10ng/mlLPS刺激24h后再給予300ng/ml LPS刺激;②內(nèi)毒素非耐受組(NETTGroup):直接給予LPS刺激(300ng/ml)。兩組分別在處理后0，5，10，30，60min收獲細(xì)胞。熒光實(shí)時(shí)定量PCR(Q-PCR)檢測(cè)TRAF3 mRNA表達(dá)變化，Western blotting及激光共聚

3、焦檢測(cè)TRAF3蛋白變化及K48泛素化(K48-Ub)水平;ELISA法檢測(cè)KCs培養(yǎng)上清液中IL-1、IL-10，TNF-α的分泌情況。結(jié)果:(1)免疫熒光染色可見(jiàn)F4/80分子在細(xì)胞膜強(qiáng)表達(dá)，KCs純度大于92.0％，臺(tái)盼藍(lán)染色顯示細(xì)胞的活力均在98.5％以上，吞墨試驗(yàn)見(jiàn)KCs吞噬大量碳素顆粒。(2)內(nèi)毒素耐受組與非耐受組TRAF3的mRNA表達(dá)量顯著在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)無(wú)顯著性差異(P＞0.05);但耐受組TRAF3蛋白表達(dá)量在觀察時(shí)間段

4、內(nèi)顯著高于非耐受組(P＜0.05);耐受組與非耐受組相比，K-48泛素化水平明顯降低(P＜0.05)。(3)耐受組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1、TNF-α的量顯著低于非耐受組(P＜0.05);耐受組IL-10分泌量顯著高于非耐受組(P＜0.05)。結(jié)論:內(nèi)毒素耐受時(shí)KCs細(xì)胞中TRAF3基因表達(dá)無(wú)明顯變化，TRAF3蛋白K-48泛素化降解受阻，導(dǎo)致TRAF3蛋白表達(dá)量相對(duì)增高。
　　第二部分:抑制TRAF3泛素化降解對(duì)MAPK及TRI

5、F信號(hào)通路的影響
　　目的:細(xì)胞凋亡抑制蛋白2(cIAP2)是TRAF3的特異性泛素連接酶，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)降低cIAP2的表達(dá)來(lái)抑制TRAF3的泛素化降解，探討TRAF3的降解被抑制后對(duì)KCs內(nèi)MAPK及TRIF信號(hào)通路的影響。方法:將分離純化的KCs以3-4×106密度接種于六孔板中，隨機(jī)分為兩組:①轉(zhuǎn)染組:構(gòu)建載有cIAP2-shRNA的慢病毒質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染48h后給予LPS(300ng/ml)刺激。②對(duì)照組:轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒48h后給予

6、LPS(300ng/ml)刺激。兩組分別于處理后0，5，10，30，60min收獲細(xì)胞，激光共聚焦檢測(cè)cIAP2、TRAF3及K-48Ub蛋白表達(dá);Westernblotting檢測(cè)cIAP2、TRAF3、K-48Ub、JNK、p-JNK、p38、p-p38、TRIF及IRF3蛋白表達(dá)水平變化;ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-1、TNF-α、IL-10的含量變化蛋白變化。結(jié)果:(1)轉(zhuǎn)染組cIAP2、K-48Ub蛋白表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)顯著

7、低于對(duì)照組(P＜0.05)。(2)轉(zhuǎn)染組TRAF3、TRIF及IRF3蛋白表達(dá)量顯著性高于對(duì)照組(P＜0.05)。(3)兩組JNK、p38蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化;轉(zhuǎn)染組p-JNK和p-p38蛋白表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。(4)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1、TNF-α的量顯著低于對(duì)照組(P＞0.05)，IL-10的量顯著高于對(duì)照組。結(jié)論:抑制TRAF3的泛素化降解可以負(fù)性調(diào)控MAPK信號(hào)激活，正性調(diào)控TRIF信號(hào)活化，誘導(dǎo)KC

8、s產(chǎn)生內(nèi)毒素耐受。
　　第三部分:下調(diào)TRAF3的表達(dá)對(duì)Kupffer細(xì)胞內(nèi)毒素耐受的影響
　　目的:探討下調(diào)TRAF3的表達(dá)對(duì)KCs內(nèi)MAPK、TRIF信號(hào)通路活化以及內(nèi)毒素耐受的影響。方法:將分離純化的KCs以3-4×106密度接種于六孔板中，隨機(jī)分為三組:①轉(zhuǎn)染組:構(gòu)建載有TRAF3-shRNA的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染24h后給予小劑量LPS(10ng/ml)刺激，24h后再給予大劑量LPS(300ng/ml)刺激。②內(nèi)毒素耐受組

9、:轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒24h后給予小劑量LPS(10ng/ml)刺激，等待24h后再給予大劑量LPS(300ng/ml)刺激。③內(nèi)毒素非耐受組:轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒24h后直接給予大劑量LPS（300ng/ml）刺激。三組分別于處理后0，30，60min收獲細(xì)胞，Western blotting檢測(cè)TRAF3、JNK、p-JNK、p38、p-p38、TRIF及IRF3蛋白表達(dá)水平變化;ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-1、TNF-α、IL-10的含量變化

10、蛋白變化。結(jié)果:(1)轉(zhuǎn)染組TRIF及IRF3蛋白表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)顯著低于內(nèi)毒素耐受組(P＜0.05)，但高于內(nèi)毒素非耐受組(P＜0.05)。(2)三組JNK、p38蛋白表達(dá)量沒(méi)有明顯變化;轉(zhuǎn)染組p-JNK和p-p38蛋白表達(dá)量顯著高于內(nèi)毒素耐受組(P＜0.05)，但低于內(nèi)毒素非耐受組(P＜0.05)。(3)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1、TNF-α的量顯著高于內(nèi)毒素耐受組(P＜0.05)，明顯低于內(nèi)毒素非耐受組(P＜0.05)。(4)