Kupffer細胞中TRAF3調控MAPK及TRIF信號通路誘導內毒素耐受的機制研究.pdf

1、第一部分: Kupffer細胞內毒素耐受時TRAF3基因、蛋白表達及K-48泛素化水平變化
　　目的:觀察內毒素耐受時，Kupffer細胞(KCs)內腫瘤壞死因子受體相關因子3(TRAF3)基因及蛋白表達變化，K-48泛素化水平以及下游細胞因子的分泌情況。方法:采用離體膠原酶消化、密度梯度離心聯(lián)合選擇性貼壁法分離KCs，F(xiàn)4/80免疫熒光染色鑒定KCs的純度，臺盼藍拒染及吞墨實驗判斷KCs的活性及吞噬功能，光鏡下動態(tài)觀察KCs隨時

2、間的形態(tài)變化。將分離、培養(yǎng)的KCs以3-4×106密度接種于六孔板中，并隨機分為2組:①內毒素耐受組(ETT Group):給予10ng/mlLPS刺激24h后再給予300ng/ml LPS刺激;②內毒素非耐受組(NETTGroup):直接給予LPS刺激(300ng/ml)。兩組分別在處理后0，5，10，30，60min收獲細胞。熒光實時定量PCR(Q-PCR)檢測TRAF3 mRNA表達變化，Western blotting及激光共聚

3、焦檢測TRAF3蛋白變化及K48泛素化(K48-Ub)水平;ELISA法檢測KCs培養(yǎng)上清液中IL-1、IL-10，TNF-α的分泌情況。結果:(1)免疫熒光染色可見F4/80分子在細胞膜強表達，KCs純度大于92.0％，臺盼藍染色顯示細胞的活力均在98.5％以上，吞墨試驗見KCs吞噬大量碳素顆粒。(2)內毒素耐受組與非耐受組TRAF3的mRNA表達量顯著在各個時間點無顯著性差異(P＞0.05);但耐受組TRAF3蛋白表達量在觀察時間段

4、內顯著高于非耐受組(P＜0.05);耐受組與非耐受組相比，K-48泛素化水平明顯降低(P＜0.05)。(3)耐受組細胞培養(yǎng)上清液中IL-1、TNF-α的量顯著低于非耐受組(P＜0.05);耐受組IL-10分泌量顯著高于非耐受組(P＜0.05)。結論:內毒素耐受時KCs細胞中TRAF3基因表達無明顯變化，TRAF3蛋白K-48泛素化降解受阻，導致TRAF3蛋白表達量相對增高。
　　第二部分:抑制TRAF3泛素化降解對MAPK及TRI

5、F信號通路的影響
　　目的:細胞凋亡抑制蛋白2(cIAP2)是TRAF3的特異性泛素連接酶，本實驗通過降低cIAP2的表達來抑制TRAF3的泛素化降解，探討TRAF3的降解被抑制后對KCs內MAPK及TRIF信號通路的影響。方法:將分離純化的KCs以3-4×106密度接種于六孔板中，隨機分為兩組:①轉染組:構建載有cIAP2-shRNA的慢病毒質粒，轉染48h后給予LPS(300ng/ml)刺激。②對照組:轉染空載質粒48h后給予

6、LPS(300ng/ml)刺激。兩組分別于處理后0，5，10，30，60min收獲細胞，激光共聚焦檢測cIAP2、TRAF3及K-48Ub蛋白表達;Westernblotting檢測cIAP2、TRAF3、K-48Ub、JNK、p-JNK、p38、p-p38、TRIF及IRF3蛋白表達水平變化;ELISA檢測細胞上清液中IL-1、TNF-α、IL-10的含量變化蛋白變化。結果:(1)轉染組cIAP2、K-48Ub蛋白表達量在各時間點顯著

7、低于對照組(P＜0.05)。(2)轉染組TRAF3、TRIF及IRF3蛋白表達量顯著性高于對照組(P＜0.05)。(3)兩組JNK、p38蛋白表達量無明顯變化;轉染組p-JNK和p-p38蛋白表達量顯著低于對照組(P＜0.05)。(4)轉染組細胞培養(yǎng)上清液中IL-1、TNF-α的量顯著低于對照組(P＞0.05)，IL-10的量顯著高于對照組。結論:抑制TRAF3的泛素化降解可以負性調控MAPK信號激活，正性調控TRIF信號活化，誘導KC

8、s產生內毒素耐受。
　　第三部分:下調TRAF3的表達對Kupffer細胞內毒素耐受的影響
　　目的:探討下調TRAF3的表達對KCs內MAPK、TRIF信號通路活化以及內毒素耐受的影響。方法:將分離純化的KCs以3-4×106密度接種于六孔板中，隨機分為三組:①轉染組:構建載有TRAF3-shRNA的質粒，轉染24h后給予小劑量LPS(10ng/ml)刺激，24h后再給予大劑量LPS(300ng/ml)刺激。②內毒素耐受組

9、:轉染空載質粒24h后給予小劑量LPS(10ng/ml)刺激，等待24h后再給予大劑量LPS(300ng/ml)刺激。③內毒素非耐受組:轉染空載質粒24h后直接給予大劑量LPS（300ng/ml）刺激。三組分別于處理后0，30，60min收獲細胞，Western blotting檢測TRAF3、JNK、p-JNK、p38、p-p38、TRIF及IRF3蛋白表達水平變化;ELISA檢測細胞上清液中IL-1、TNF-α、IL-10的含量變化

10、蛋白變化。結果:(1)轉染組TRIF及IRF3蛋白表達量在各時間點顯著低于內毒素耐受組(P＜0.05)，但高于內毒素非耐受組(P＜0.05)。(2)三組JNK、p38蛋白表達量沒有明顯變化;轉染組p-JNK和p-p38蛋白表達量顯著高于內毒素耐受組(P＜0.05)，但低于內毒素非耐受組(P＜0.05)。(3)轉染組細胞培養(yǎng)上清液中IL-1、TNF-α的量顯著高于內毒素耐受組(P＜0.05)，明顯低于內毒素非耐受組(P＜0.05)。(4)