褪黑素對內(nèi)毒素致大鼠急性肺損傷中p38MAPK信號通路的影響.pdf

1、目的：急性肺損傷(acute lung iniury，ALI)是臨床常見的由感染等多種因素引起的彌漫性肺實質(zhì)損傷，也是全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)或多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunctionsyndrome，MODS)在肺部的典型表現(xiàn)。ALI的發(fā)病的機制很復雜，迄今為止尚未完全闡明。以往的研究己證明，ALI的發(fā)生與機體肺部氧

2、化/抗氧化平衡失調(diào)有直接關(guān)系，因為當肺臟受到各種致病因素(如創(chuàng)傷、休克、感染等)嚴重打擊時，可導致肺臟局部產(chǎn)生劇烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)，進而引起ALI。革蘭氏陰性菌是臨床引起氣道和肺部炎癥的重要病原之一，其脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)成分介導炎癥細胞如肺泡巨噬細胞、中性粒細胞以及內(nèi)皮細胞等釋放大量的促炎因子、炎性介質(zhì)，此過程在炎癥反應(yīng)中起重要作用。然而，在炎癥反應(yīng)過程中，信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)起著至關(guān)重要的作用。 促分

3、裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinase，MAPK)介導的信號轉(zhuǎn)導通路是生物信號引起核反應(yīng)的重要通路，其家族主要有細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK.)、c-jun氨基未端激酶(c-Jun-NH2-terminal kinase，JNK)、p3 8MAPK和ERK-5。其中p38MAPK信號通路與ALI關(guān)系密切，是參與炎癥反應(yīng)的細

4、胞內(nèi)的重要通路，p38MAPK通過非磷酸化轉(zhuǎn)化為磷酸化狀態(tài)進而促進下游底物的磷酸化以實現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導，啟動核因子-kB(nuclear factor-kB，NF-kB)、激活蛋白-1(activatorprotein-1，AP-1)等轉(zhuǎn)錄因子，從而促進炎癥介質(zhì)分泌，介導炎癥反應(yīng)。但是，關(guān)于p38MAPK信號通路活化及上游調(diào)控機制仍不清楚。實驗表明，p38MAPK通路對機體有保護性作用。但由于TNF-α、IL-1持續(xù)高水平而導致的炎性過程可能

5、同p38MAPK的過度激活有關(guān)，尤其在LPS誘導的多種細胞因子合成的信號轉(zhuǎn)導中起到關(guān)鍵性作用。Beaty等實驗表明p38MAPK途徑介導了LPS作用的中性粒細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導，p38MAPK在LPS作用下被磷酸化活化，活化的p38MAPK即由胞漿進入胞核，轉(zhuǎn)錄生成大量的炎性因子。有研究已證明抑制p38MAPK途徑，能夠有效的抑制炎癥反應(yīng)，明顯的減輕機體的炎癥反應(yīng)。褪黑素是已發(fā)現(xiàn)的具有強抗氧化應(yīng)激作用的激素，但其作用與p38MAPK途徑是否

6、相關(guān)，國內(nèi)外無相關(guān)文獻報道，其機制尚有待研究。 褪黑素最早認為對機體的生殖系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、精神神經(jīng)系統(tǒng)和生物節(jié)律等都有明顯的調(diào)節(jié)作用，同時與睡眠、鎮(zhèn)靜等生物學行為有關(guān)。直到20世紀90年代初，Tan等首次報道MT具有抗氧化活性，是一種高效的內(nèi)源性自由基清除劑，并在抗炎方面有積極的作用，所以，MT抗ALI機制研究仍然是目前的熱點。但是，MT抗氧化抗炎作用的信號轉(zhuǎn)導途徑、生理水平MT在機體抗氧化抗炎防御體系中的地位和機制到目前仍未

7、弄清楚，所以從分子水平去解決上述問題，為MT的廣泛應(yīng)用開辟更為廣闊的前景。本課題通過氣管內(nèi)滴注LPS復制大鼠ALI模型，旨在在體實驗探討ALI和p38MAPK信號通路活化的關(guān)系及MT抗ALI機制，為MT的臨床應(yīng)用提供一定的理論和實驗依據(jù)。方法：本實驗采用氣管內(nèi)滴注LPS復制大鼠ALI模型，并通過腹腔給予MT，觀察不同時間點丙二醛(malonaldehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、一

8、氧化氮(nitrogen monoxidum，NO)、肺組織病理學改變及肺組織中p38MAPK蛋白的表達變化。 將72只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重190～220克，隨機分為3組，每組24只。①Control組：經(jīng)氣管滴注無熱源生理鹽水(NS)，每只200μl，并在滴注前后30min分別腹腔注射(ip)溶媒(1％乙醇生理鹽水)1ml/kg；②LPS組：經(jīng)氣管滴注LPS(200μg/200 μl/只)，并在滴

9、注前后30min分別ip溶媒1ml/kg；③LPS+MT組：經(jīng)氣管滴注LPS(200μg/200μl/只)，并在滴注前后30min分別ip MT 10mg/kg。各組動物分別于滴注LPS后3h、6h和10h經(jīng)頸總動脈放血處死，同時留取肺部標本。肺部標本分為三部分：一部分制備勻漿檢測MDA、SOD、NO的活性和含量變化；一部分觀察其形態(tài)學變化，同時采用免疫組織化學染色和圖像分析觀察肺組織中p38MAPK蛋白的表達和分布；另一部分勻漿采用W

10、esternblot技術(shù)觀察肺組織中p38MAPK蛋白的表達變化。 數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差((ˉx)±s)來表示，組間差異用單因素方差分析(one way ANOVA)，有顯著差異者用SNK-q檢驗進行兩兩比較，均以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果：1 肺組織中MDA含量的變化：與Control組相應(yīng)時間點比較，LPS組經(jīng)氣管內(nèi)滴注LPS后3h、6h和lOh肺組織中MDA含量顯著升高(P均＜0.01)，且10h時達到高峰

11、，相鄰時間點之間有顯著差異(P均＜0.01)：與LPS組相應(yīng)時間點比較，LPS+MT組肺組織MDA含量明顯降低(P均＜0.01)，但仍高于Control組(P均＜0.01)。 2 肺組織中SOD活性的變化：與Control組相應(yīng)時間點比較，LPS組經(jīng)氣管內(nèi)滴注LPS后3h、6h和10h肺組織中SOD活性顯著降低(P均＜0.01)，且10h時活性降到最低，相鄰時間點之間有顯著差異(P均＜0.01)；與LPS組相應(yīng)時間點比較，LPS+MT組

12、肺組織SOD活性明顯升高(P均＜0.01)，但仍低于Control組(P均＜0.01)。 3.肺組織中NO含量的變化：與Control組相應(yīng)時間點比較，LPS組經(jīng)氣管內(nèi)滴注LPS后3h、6h和10h肺組織中NO含量顯著升高(P均＜0.01)，且10h時達到高峰，相鄰時間點之間有顯著差異(P均＜0.01)；與LPS組相應(yīng)時間點比較，LPS+MT組肺組織NO含量明顯降低(P均＜0.01)，但仍高于Control組(P均＜0.01)。

13、 4 肺組織形態(tài)學觀察：Control組肺泡結(jié)構(gòu)清晰，壁薄，肺泡腔內(nèi)無滲出液；滴注LPS后3h肺泡間隔明顯增厚，肺泡萎陷及炎細胞浸潤，6h時其結(jié)構(gòu)已無法辨認，10h時改變更加顯著；LPS+MT組3h改變同Control組，6h與10h時肺泡結(jié)構(gòu)仍然存在，肺泡間隔略增厚，PMN浸潤較LPS組明顯減輕，肺泡腔內(nèi)滲出不明顯，但個別區(qū)域炎癥改變較突出。 5 肺組織免疫組織化學染色觀察：Control組氣道和肺組織可見反應(yīng)較弱的p

14、38MAPK陽性細胞，LPS組p38MAPK陽性細胞較對照組明顯增多(10h時表達達到高峰，P＜0.05或P＜0.01)，主要分布于浸潤的炎癥細胞、氣道上皮細胞、肺泡上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞。LPS+MT組氣道和肺組織中陽性細胞分布與LPS組類似，但陽性信號明顯減弱(10h時P均＜0.01)。 6 肺組織Western blot分析發(fā)現(xiàn)：Control組可見肺組織p38MAPK蛋白有少量表達。LPS組各時間點與Control組相比，p38

15、MAPK蛋白表達顯著升高，10h時達到高峰，表現(xiàn)為p38MAPK與β-actin的IOD值的比值升高(P＜0.05或P＜0.01)。LPS+MT組各時間點與LPS組相比，p38MAPK蛋白表達下降，表現(xiàn)為p38MAPK與β-actin的IOD值的比值下降(P均＜0.05)，但仍高于Control組。 結(jié)論：1 氣管內(nèi)滴注LPS可引起大鼠肺組織嚴重的炎癥反應(yīng)，說明成功地復制了ALI動物模型。 2.LPS誘發(fā)的大鼠急性肺損傷