阻斷Kupffer細胞中IRE1-XBP1通路誘導大鼠肝移植免疫耐受形成的機制研究.pdf

1、背景:
　　肝臟移植是目前治療終末期肝臟疾病最有效的治療選擇。但移植術后急性排斥反應發(fā)生造成的移植物失功仍未得到理想的解決。受困于供體肝來源緊缺的國際大環(huán)境，更使得如何誘導移植術后移植肝特異性免疫耐受一直是移植領域的研究熱點及重點。我們的團隊前期研究發(fā)現,Kupffer細胞（KCs）作為體內具有高效抗原呈遞功能的巨噬細胞群，在術后誘導移植肝臟免疫耐受中起著雙重效應，但其確切機制目前尚不清楚。可能與誘導Th亞群細胞間動態(tài)平衡以及自身

2、極化有關。新近發(fā)現肌醇酶1-X盒連接蛋白1（Inositol Requiring1-X Box Binding Protein1,IRE1-XBP1）通路不僅參與了非折疊蛋白反應（Unfold Protein Response,UPR），還對抗原呈遞細胞（Antigen Presenting Cells, APCs）的功能具有調節(jié)作用，但并未涉及肝移植領域。因此探索KCs中IR E1-XBP1通路活性在移植肝免疫反應中的作用與機制，可能

3、為臨床實踐提供新的靶點以及理論依據。
　　第一部分.IRE1-XBP1對Kupffer細胞功能的調控及對初始T淋巴細胞功能和分化的影響
　　目的:分離、培養(yǎng) LEWIS大鼠肝臟KCs，通過抑制或上調KCs中IR E1-XBP1活性，觀察這一通路對KCs功能的調控及其對初始T淋巴細胞功能及分化的作用機制。
　　方法:
　?、俨扇V型膠原酶消化肝臟聯合非連續(xù)梯度離心法分離Lewis大鼠KCs；
　?、诿庖呓M化

4、、激光共聚焦分別檢測KCs表面CD68和CD163的表達來鑒定KCs；
　　③吞墨以及吞熒光乳膠顆粒實驗來判斷KCs的吞噬能力；臺盼藍染色鑒定KCs的活性。鑒定后的KCs隨機分為四組：XBP1抑制組（XBP1-shRNA group）；錯義序列沉默對照組（Scrambled-shRNA group，Ctrl-shRNA）；XBP1過表達組（AdV-XBP1 group）；錯義序列過表達對照組(AdV-Scrambled group

5、，Ctrl-AdV)；
　?、軣晒怙@微鏡下以及激光共聚焦檢測法評估質粒轉染效率；
　　⑤RT-PCR以及Western Blot檢測各組KCs中XBP1、IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17、JAK1、JAK2、STAT1以及STAT3的基因及蛋白表達水平；
　?、蘖魇郊毎g（FCM）以及激光共聚焦檢測各組 KCs表型的變化情況；
　　⑦ELISA檢測KCs自分泌IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-1

6、7的水平；
　?、喾蛛x大鼠脾臟淋巴細胞，尼龍毛柱過濾純化T細胞，FCM檢測純度，與上述各組KCs共培養(yǎng)，MTT法及Brdu滲入法檢測T細胞增殖情況；
　?、?Annexin V/PI法FCM觀察T淋巴細胞凋亡情況；⑩ELISA測定上清液中IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17及IL-10含量。
　　結果:
　?、貹Cs細胞表面CD68和CD163呈強陽性及強熒光強度表達，提示我們提取的是大鼠的KCs。吞噬實

7、驗以及臺盼藍染色提示分離培養(yǎng)的KC s具有良好的吞噬能力及活性；
　　②轉染XBP1的沉默質粒以及過表達質粒后，6h開始零星出現熒光表達，48小時前后達到高峰，2w后開始逐漸下降；RT-PCR以及WB結果顯示，XBP1沉默組中XBP1的表達量較對照組顯著降低，而在XBP1過表達組則明顯上調；
　?、跢CM以及激光共聚焦術發(fā)現，XBP1沉默組中MHC-II、CD86、CD40的表達明顯低于對照組，而CD204和CD206的表達

8、則顯著高于對照組；而在XBP1過表達組，則呈相反趨勢；
　?、躓B檢測發(fā)現XBP1沉默組中JAK1、JAK2、STAT1和STAT3的蛋白表達及其磷酸化水平均受到抑制，而在XBP1過表達組則上述蛋白的表達及磷酸化水平得到顯著增強；
　?、軫CM檢測T細胞純度為78.73±4.35％，其中CD4+為58.84±10.47%，CD4+/CD8+T細胞比例為2.95。和各組KCs共培養(yǎng)3d后，發(fā)現抑制KCs中IR E1-XBP1活

9、性后T細胞增殖受到明顯抑制，凋亡增加，促炎細胞因子分泌減少，抗炎細胞因子分泌增加（P<0.05），而上調KCs中IR E1-XBP1活性后T細胞增殖則明顯增強，凋亡明顯減少，促炎細胞因子（IFN-γ、TNF-α）分泌增加，抗炎細胞因子（IL-10）分泌減少（P<0.05）。
　　結論:
　?、貹Cs中IRE1-XBP1通路活性變化可以轉化 KCs的極性狀態(tài)，并通過調節(jié)JAK-S TAT家族成員表達，調控KCs自分泌細胞因子的

10、組成成分；
　?、贙Cs中IR E1-XBP1通路活性變化可以影響共培養(yǎng)初始T淋巴細胞的增殖分化、凋亡以及相關細胞因子的分泌。
　　第二部分.大鼠原位肝移植急性排斥模型建立和攜XBP1-shRNA質粒的脂質包裹液態(tài)氟碳納米粒靶向轉染Kupffer細胞的效果評估
　　目的:建立LEWIS-BN大鼠原位肝移植急性排斥反應模型，用攜帶XBP1-shRNA的脂質包裹氟碳納米粒（perfluorocarbonnanopartic

11、les，PFCN）與XBP1-shRNA慢病毒分別轉染上述急性排斥反應模型，評價兩種不同轉染載體對KCs靶向性干擾的高低。
　　方法:采用改良Kamada"雙套管"法建立LEWIS-BN大鼠原位肝移植急性排斥反應模型；采用兩步乳化法制作脂質包裹的PFCN乳液，通過正負電荷連接XBP1-shRNA質粒。
　?、賆BP1-shRNA-PFCNP組：經門靜脈注射XBP1-shRNA-PFCNP(1ml/1000g),1x109Tu

12、/mL，再推注2mL生理鹽水;
　?、赬BP1-shRNA-Lentivirus組：經門靜脈注射XBP1-shRNA-Lentivirus2mL，1x109Tu/mL；
　?、蹖φ战M：經門靜脈推注生理鹽水2mL。觀察轉染后3天及7天KCs、肝細胞、脾臟及小腸中XBP1的表達改變。
　　結果:
　?、貾FH以1：8的比例、聲震時間80s得到性質穩(wěn)定的平均粒徑為283.78±23.16的PFCN；成功建立穩(wěn)定的LEW

13、IS-BN大鼠原位肝移植模型；
　?、赗T-PCR與WB結果提示：術后第3d，PFCN組及慢病毒組均能有效抑制KCs中XBP1的表達，抑制效率未見統(tǒng)計學差異；同時兩種方式對肝細胞及小腸內XBP1也有抑制作用，但慢病毒組抑制程度明顯高于PFCN組；
　?、坌g后7d，慢病毒組對KCs中XBP1的抑制程度明顯弱于PFCN組，而對肝細胞內XBP1的抑制作用則明顯強于PFCN組；PFCN組對脾和小腸的影響與對照組無統(tǒng)計學差異，而慢病毒

14、組則持續(xù)抑制，但抑制率較3d時減弱。
　　結論:LEWIS-BN是一種穩(wěn)定的大鼠肝移植急性排斥反應模型；采用改良"雙套管"法能穩(wěn)定高效的構建這一模型；攜帶XBP1-shRNA的PFCN作為轉染載體，較慢病毒經由門靜脈高壓注射轉染，具有更高的KCs靶向性以及抑制效率。
　　第三部分.阻斷Kupffer細胞中IRE1-XBP1通路活性誘導大鼠肝移植免疫耐受的實驗研究
　　目的:觀察阻斷移植肝KCs中IR E1-XBP1通路

15、活性對大鼠肝移植急性排斥反應模型的作用及機制。
　　方法:
　?、俨扇「牧肌癒amada”雙套管法建立LEWIS-BN大鼠肝移植急性排斥反應模型；
　?、谑荏w隨機分為三組：生理鹽水組（NS），錯義序列沉默對照組（Scrambled-shRNA group，Ctrl-shRNA）和沉默組（XBP1-shRNA），劑量參考第二部分。
　?、塾^察術后7天各組受體生存時間與肝功能變化；移植肝病理改變；
　?、躎UN

16、EL檢測移植區(qū)細胞凋亡情況；
　　⑤Real-time PCR檢測肝組織中T-bet、RORγt、IFN-γ、IL-17及IL-10 mRNA表達水平；Western Blot檢測移植肝中CD40、CD86、CD204、CD206、IFN-γ、IL-17及IL-10蛋白表達水平；
　　⑥ELISA檢測外周血中IFN-γ、IL-17和IL-10的表達水平。
　　結果:
　?、傩g后第7天，沉默組受體存活時間以及肝功能

17、較其余兩組得到明顯的改善（P<0.05）；RAI評分屬輕度排斥反應，其余兩組呈重度排斥反應。TUN EL顯示沉默組匯管區(qū)淋巴細胞凋亡程度遠遠高于對照組以及生理鹽水組。
　?、诔聊M中T-bet、RORγt、IFN-γ、IL-17的mRNA相對表達量均明顯低于對照組以及生理鹽水組（P<0.05）。而IL-10的含量則高于其余兩組（P<0.05）。
　　③沉默組中CD40、CD86、IFN-γ、IL-17的蛋白表達明顯減弱，而C

18、D204、CD206和IL-10的蛋白水平則較其余兩組明顯上調（P<0.05）。
　　④ELISA結果提示隨著移植后時間的推移，沉默組外周血清中IFN-γ、IL-17的表達量與對照組以及生理鹽水組比較，逐漸降低（P<0.05）；而IL-10的表達則逐漸增加（P<0.05）。
　　結論:體內阻斷KCs中IRE1-XBP1通路能顯著減輕AcR對肝臟組織的破壞程度并誘導免疫耐受形成；其機制可能與誘導活化M1樣KCs向M2樣KCs轉