魚藤酮對大鼠海馬MAPK-ERK信號傳導通路調(diào)控機制的研究.pdf

1、魚藤酮是一種應用廣泛的農(nóng)業(yè)殺蟲劑，能選擇性地結合并抑制線粒體復合物Ⅰ，從而破壞細胞呼吸鏈的正常功能。流行病學資料顯示，長期低劑量接觸魚藤酮的人群帕金森病的發(fā)病機率高于未暴露人群。動物實驗進一步證實，魚藤酮能作用于黑質(zhì)一紋狀體多巴胺能神經(jīng)元，使之發(fā)生凋亡。海馬組織的膽堿能神經(jīng)元與黑質(zhì)紋狀體的多巴胺能神經(jīng)元間聯(lián)系密切，而MAPIGERK信號傳導通路在學習記憶的形成鞏固及神經(jīng)元凋亡的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著一定的作用。因此，研究魚藤酮對海馬MAPK/

2、ERK級聯(lián)的調(diào)控機制以及活化后的ERK1/2在神經(jīng)元凋亡中的具體作用，對于我們從新的角度了解環(huán)境因素在神經(jīng)退行性疾病中的作用機理以及魚藤酮致細胞凋亡的具體作用途徑提供相關的理論依據(jù)。 目的：通過體內(nèi)外實驗闡明魚藤酮對大鼠海馬MAPK/ERK信號傳導通路的上游調(diào)控機制，初步判斷MAPK/ERK級聯(lián)在魚藤酮致海馬神經(jīng)元凋亡中的作用機理，了解環(huán)境毒物的具體作用靶點，從而為神經(jīng)退變性疾病的研究提供理論依據(jù)。 方法：(1)建立大鼠

3、魚藤酮染毒模型，觀察大鼠一般情況變化，HE染色檢測心、肝、脾、腎的改變，以了解魚藤酮對動物的一般損傷情況。(2)采用HE染色、FJB復合尼氏熒光染色、[ca<'2+>]<,i>檢測、免疫組化、Western蛋白印跡法等多種實驗技術，觀察魚藤酮作用對大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響以及ERK1/2活化情況，檢測ERK1/2主要上游調(diào)控蛋白因子表達情況。(3)建立原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元魚藤酮染毒模型，倒置顯微鏡觀察魚藤酮體外作用對神經(jīng)元的影響；MT

4、T法檢測細胞活性改變；Annexin-Ⅴ-FITC/PI雙標法檢測細胞調(diào)亡情況；激光共聚焦顯微鏡檢測神經(jīng)元[Ca<'2+>]<,i>變化；通過加入MEK抑制劑PD98059、L型Ca<'2+>通道阻斷劑Nimodipine、PKA抑制劑KT5720、PKC抑制劑Chelerythrine以及raf-1蛋白激活阻斷劑Sulindac Sulfide預處理細胞與單純?nèi)径颈容^，免疫組化觀察磷酸化ERK1/2的變化情況。 結果：(1)成

5、功建立了微量滲透泵植埋魚藤酮大鼠染毒模型，大鼠出現(xiàn)類似帕金森病的癥狀。HE染色顯示中毒組大鼠心、肝、脾、腎出現(xiàn)不同程度的病理學改變，其中以肝腎改變最為顯著。(2)FJB復合尼氏熒光染色顯示染毒組大鼠海馬內(nèi)出現(xiàn)退變神經(jīng)元，免疫組化及Western蛋白印跡法提示染毒組大鼠海馬內(nèi)磷酸化ERK1/2和Ras蛋白表達量與對照組比較有所增高，染毒組大鼠海馬神經(jīng)元[Ca<'2+>]<,i>升高明顯，而PKC和PKA激酶的活性也有一定程度的升高。(3)

6、成功建立體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元魚藤酮染毒模型，鏡下觀察隨著魚藤酮染毒濃度升高、時間延長，神經(jīng)元出現(xiàn)不同程度的形態(tài)學變化。主要表現(xiàn)為細胞皺縮、折光性增強甚至細胞漂浮。MTT法進一步證實魚藤酮隨著染毒濃度的升高和時間的延長，細胞活性呈下降趨勢。流式細胞儀檢測提示魚藤酮體外作用可以誘導細胞凋亡，PD98059預處理復合染毒與單純?nèi)径颈容^凋亡率在染毒8h時有顯著升高。不同劑量、不同時間魚藤酮染毒處理后神經(jīng)元[ca<'2+>]<,i>與對照組比較均有

7、所升高，且Nimodipine預處理可以在特定的時間里阻斷[Ca<'2+>]<,i>的升高。不同阻斷抑制劑預處理后與單純?nèi)径颈容^發(fā)現(xiàn)，PD98059和Sulindac Sulfide可以下調(diào)磷酸化ERK1/2的表達水平，而Nimodipine，KT5720和Chelerythrine預處理沒有顯著改變。 結論：(1)魚藤酮對大鼠全身毒性作用顯著，對肝、腎損傷作用明顯。(2)魚藤酮體內(nèi)、外作用均可以誘導大鼠海馬神經(jīng)元發(fā)生凋亡。魚藤

8、酮可以激活大鼠海馬MAPK/ERK信號傳導通路導致ERK1/2磷酸化水平升高，活化的ERK1/2可能參與了細胞凋亡的發(fā)生發(fā)展，并在其中起到保護作用。 (3)魚藤酮染毒條件下Ca<'2+>在海馬神經(jīng)元胞體內(nèi)的升高早期主要不是通過L-型Ca<'2+>通道的作用，L-型Ca<'2+>通道主要在魚藤酮染毒中期發(fā)揮作用，是中期胞內(nèi)Ca<'2+>升高的主要途徑。低劑量魚藤酮刺激即會引起[Ca<'2+>]<,i>顯著升高，但其升高有一定限度，不呈時間