低硒膳食對仔三代大鼠腦MAPK信號傳導通路影響的初步研究.pdf

1、背景與目的：
　　在全民補碘二十年余后,碘缺乏病已經(jīng)得到基本控制的今天,仍有大量弱智兒童出現(xiàn)的事實,促使我們在補碘的同時尋找影響神經(jīng)細胞發(fā)育的碘外因素。硒作為對腦發(fā)育影響的一個重要元素越來越引起學者們的關(guān)注。已有研究表明硒作為硒蛋白的必需組份,是體內(nèi)許多酶的重要構(gòu)成成分和活性中心[5,6],它在機體中發(fā)揮著重要的作用,如谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、甲狀腺激素代謝調(diào)節(jié)的三種脫碘酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型、硒蛋白P、硒蛋白W等[7,8]。

2、這些含硒酶對神經(jīng)細胞發(fā)育有著重要的影響。課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)硒對大鼠腦神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有一定的影響。但在低硒時,與神經(jīng)細胞增殖分化密切相關(guān)EGFR/MAPK(ERK1/2)信號傳導通路的實驗研究未見有文獻報道。本研究以本課題組已經(jīng)建立的連續(xù)人工膳食性低硒動物模型仔三代SD大鼠為實驗對象,分別檢測和分析了對照(補硒補碘)、單純低碘、單純低硒和低硒低碘仔三代新生4天和斷乳21天大鼠腦海馬、前皮層的增殖分化相關(guān)蛋白EGFR,及其下游MAPK信號蛋

3、白表達及對MAPK級聯(lián)下游增殖分化相關(guān)核基因c-Fos及對增殖信號傳導起調(diào)節(jié)作用的神經(jīng)遞質(zhì)受體5-HT1AR表達的影響。試圖初步探索在低硒時MAPK信號通路主要相關(guān)信號分子的變化,為進一步深入探討硒和硒碘聯(lián)合缺乏對神經(jīng)細胞生長發(fā)育影響的分子機制提供實驗依據(jù)。
　　材料與方法：
　　利用本課題組已建立的連續(xù)人工膳食性低硒動物模型仔三代大鼠,檢測對照組(補硒補碘組,CTL)、單純低碘組(I-)、單純低硒組(Se-)和低硒低碘組(

4、Se-I-)的新生4天和斷乳21天大鼠腦海馬、前皮層部位的EGFR、a-MAPK、a-PERK1/2、c-Fos、5-HT1AR蛋白的表達,利用免疫組織化學進行蛋白表達的形態(tài)學定位,并用Western blot方法檢測組織蛋白的表達并利用Bio-RadQuantity4.5.2軟件分析其表達水平。
　　結(jié)果：
　　結(jié)果 I:低硒膳食對仔三代新生鼠(4日齡)大鼠腦MAPK信號傳導通路主要相關(guān)蛋白表達的影響
　　一.新生4

5、日齡鼠腦增殖分化相關(guān)蛋白EGFR的表達
　　1.免疫組化:
　　海馬部位:海馬CA1區(qū)各實驗組EGFR蛋白表達與對照組相比表達均降低,以低硒低碘組最低,低碘組其次;但各組間兩兩比較無顯著差異。海馬CA3區(qū) EGFR蛋白表達各實驗組與對照組相比表達均降低,以低硒低碘組最低(P<0.01),低硒組其次(P<0.01),低碘組再次(P<0.05)。
　　前皮層部位:各實驗組 EGFR蛋白表達與對照組相比表達均降低,以單純低硒

6、組最低,單純低碘組其次(各實驗組與對照組間比較P<0.01)。
　　2.Western blot檢測4日齡全腦 EGFR蛋白分析:各組間 EGFR蛋白表達略有差異,但差異均沒有統(tǒng)計學意義。
　　二、新生4日齡鼠MAPK和p-ERK1/2蛋白的表達
　　(一)、新生4日齡鼠MAPK(ERK1/2)蛋白的表達:免疫組化海馬、前皮層部位及Western blot全腦MAPK表達結(jié)果均顯示:各實驗組與對照組間比較沒有統(tǒng)計學差異

7、。
　　(二).新生4日齡鼠p-MAPK(p-ERK1/2)蛋白的表達。
　　1.免疫組化
　　海馬部位:海馬CA1區(qū)各實驗組p-MAPK表達平均陽性細胞絕對數(shù)比對照組明顯降低(P<0.01),單純低硒組表達幾乎陰性,低硒低碘組其次。海馬CA3區(qū)各實驗組p-MAPK表達比對照組表達明顯降低(P<0.01),單純低硒組表達幾乎陰性,低硒低碘組其次。
　　前皮層部位:各實驗組p-MAPK表達與對照組相比表達均降低(P

8、<0.01),以低硒組最低,低硒低碘組其次。
　　2. Western blot檢測4日齡鼠全腦p-MAPK(p-ERK1/2)蛋白分析:
　　p-ERK1(p-P44MAPK)蛋白表達:各實驗組與對照組間比較p-ERK1磷酸化程度都有表達降低的趨勢,以單純低硒組(P=0.090)最低,低硒低碘組其次,但沒有顯著性差異。
　　p-ERK2(p-P42MAPK)蛋白表達:各實驗組與對照組間比較p-ERK2磷酸化程度都有表

9、達降低的趨勢,以低硒組表達最低,低硒低碘組其次,但沒有顯著性差異。
　　三、新生4日齡鼠核蛋白c-Fos的表達
　　1.免疫組化
　　海馬部位:海馬CA1區(qū)c-Fos蛋白表達低碘組(P<0.05)及低硒組與對照組相比表達增加;低硒低碘組表達降低,但沒有統(tǒng)計學差異;海馬CA3區(qū)c-Fos蛋白表達低碘組(P<0.01)及低硒低碘組(P<0.05)與對照組間比較表達增加;低硒組與對照組間比較表達降低,但無統(tǒng)計學差異。

10、　　前皮層部位:各實驗組與對照組間比較均沒有顯著性差異。
　　2.Western blot檢測4日齡鼠全腦c-Fos蛋白分析:各實驗組間兩兩比較均沒有顯著性差異。
　　四、4日齡鼠腦神經(jīng)遞質(zhì)受體5-HT1AR蛋白的表達
　　1.免疫組化
　　海馬部位:海馬CA1區(qū)5-HT1AR蛋白各實驗組與對照組相比表達均降低(P<0.01),以低硒低碘組表達最低,低硒組其次。海馬CA3區(qū)各實驗組與對照組相比表達均降低,以低硒低

11、碘組表達最低(P<0.01),低硒組其次(P<0.01);
　　前皮層部位:5-HT1AR蛋白各實驗組與對照組間比較沒有統(tǒng)計學顯著性差異。
　　2.Western blot檢測4日齡全腦5-HT1AR蛋白分析:各實驗組與對照組間比較均沒有顯著差異。
　　結(jié)果 II低硒膳食對仔三代發(fā)育期(21日齡)斷乳大鼠腦 MAPK信號傳導通路主要相關(guān)蛋白表達的影響
　　一、21日齡鼠腦增殖分化相關(guān)蛋白 EGFR的表達
　

12、　海馬部位:海馬CA1區(qū) EGFR蛋白各實驗組與對照組相比表達均降低,以低硒低碘組最低(P<0.01),低硒組其次(P<0.01)。海馬CA3區(qū)各實驗組與對照組相比表達均降低,以低硒低碘組最低(P<0.01),低硒組其次(P<0.01)。
　　前皮層部位:各實驗組 EGFR蛋白表達與對照組相比表達均降低,以低硒低碘組最低(P<0.01),低碘組其次(P<0.01)。
　　二、21日齡鼠腦 MAPK(ERK1/2)和p-ERK

13、1/2蛋白的表達
　　1.21日齡鼠腦MAPK(ERK1/2)蛋白的表達
　　海馬及前皮層部位:各實驗組MAPK蛋白與對照組間比較無顯著差異。
　　2.21日齡鼠腦p-MAPK(p-ERK1/2)蛋白的表達
　　海馬部位:海馬CA1區(qū)各實驗組p-MAPK蛋白與對照組相比表達均降低(P<0.01),以單純低硒組表達最低,低硒低碘組其次。海馬CA3區(qū)各實驗組與對照組相比表達均降低(P<0.01),以低硒低碘組表達最低

14、,單純低硒組其次。
　　前皮層部位:各實驗組p-MAPK蛋白與對照組相比表達均降低(P<0.01),以單純低硒組表達最低,單純低碘組其次。
　　三、21日齡鼠腦核基因c-Fos的表達
　　海馬部位:海馬CA1區(qū)c-Fos蛋白低碘組比對照組c-Fos表達增加(P<0.05);低硒組表達比對照組降低,但無統(tǒng)計學差異;低硒低碘組表達陰性。海馬CA3區(qū)各實驗組比對照組表達均增加,以低硒低碘組最高(P<0.05),低碘組其次(P

15、=0.05)。海馬齒狀回(dentate gyrus,DG)顆粒神經(jīng)元各實驗組比對照組表達均增加,以低硒低碘組最高(P<0.01),低碘組其次(P<0.05)。
　　前皮層部位:單純低碘組及單純低硒與對照組相比表達增加(P<0.01),以低碘組表達最高;低硒低碘組與對照組相比表達降低(P<0.05)。
　　四、21日齡鼠腦神經(jīng)遞質(zhì)受體5-HT1AR蛋白的表達
　　海馬部位:海馬CA1區(qū)5-HT1AR蛋白低碘組及低硒組與

16、對照組相比表達均增加,以單純低碘組表達最高(P<0.01),低硒組其次(P<0.05);低硒低碘組與對照組相比表達降低(P<0.01)。海馬CA3區(qū)5-HT1AR蛋白低碘組及低硒組與對照組相比表達均增加(P<0.01),以單純低碘組表達最高;低硒低碘組表達降低,但無統(tǒng)計學差異。
　　前皮層部位:各實驗組5-HT1AR蛋白與對照組相比表達均增加,以單純低碘組表達最高(P<0.01),低硒低碘組其次(P<0.01)。
　　結(jié)論：