筋膜在針刺信號傳導中的作用及其與MAPK通路的相關研究.pdf

1、本研究擬通過免疫組織化學和免疫印跡方法等技術手段觀察針刺后穴位區(qū)和非穴位區(qū)筋膜結(jié)締組織中MAPK信號通路蛋白的變化，以進一步從微觀角度為“筋膜與經(jīng)絡”相關的理論提供佐證，并進一步解釋筋膜結(jié)締組織支架對人體生理病理狀態(tài)的調(diào)節(jié)作用。 研究目的: 1、通過觀察針刺前后筋膜的形態(tài)學改變，探討針刺作為一種機械應力，在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導進而引起生物學反應的最為基礎的反應-組織學形變是如何發(fā)生的。并且探討針刺作為一種傷害性刺激，對于脊髓的形態(tài)

2、學有無影響。 2、通過免疫組織化學染色，觀察針刺前后ERK1/2和P38MAPK在針刺局部淺筋膜組織和脊髓的表達及其在細胞內(nèi)的定位和移位情況，從針刺局部和脊髓兩個解剖學層面和信號轉(zhuǎn)導角度探討針刺影響機體的機理。 3.通過比較穴位和非穴區(qū)筋膜ERK的表達情況，從筋膜結(jié)締組織角度探討穴位的特異性；通過觀察針刺后不同時間點ERK信號蛋白表達的差異，探討針刺后對于筋膜的最佳取材時間點，為進一步的研究打下基礎。 4.通過W

3、estern-Blot免疫印記技術，半定量觀察各組大鼠ERK1/2和P38MAPK在針刺局部淺筋膜組織和肌肉組織的表達強弱，探討針刺對局部的筋膜、肌肉的影響差異，以及針刺對穴位和非穴區(qū)信號蛋白影響的差異，為“筋膜與經(jīng)絡”相關理論提供進一步的佐證。 材料與方法: 1、針刺對局部筋膜結(jié)締組織和脊髓形態(tài)學的影響。25只SD大鼠隨機分為5組，每組5只?？瞻讓φ战M不施加任何處理，手針非穴位組在大鼠右側(cè)腹股溝中點處針刺，隔日1次。手

4、針后三里組大鼠針刺入后三里穴后，行針方法如手針非穴位組。電針后三里組大鼠針刺得氣后，連6805AⅡ型電針儀，頻率2HZ。治療10次后取材。各針刺組大鼠分別取以針刺點為圓心，直徑約1.5cm的區(qū)域的淺筋膜約200mg，空白對照組在非穴針刺點的相應位置取材。經(jīng)4%多聚甲醛固定，經(jīng)沖洗、脫水、透明等處理后，分別制作2張石蠟切片用于HE染色。然后各組大鼠經(jīng)4%多聚甲醛灌注，“微型椎板咬骨鉗”取出脊髓組織后制作2張石蠟切片用于HE染色。利用Oly

5、mpus圖像分析系統(tǒng)分析HE染色圖像。 拉伸刺激組大鼠于腰1-2水平脊柱旁開2cm處局部備皮，消毒，以針尾為參照物順時針捻轉(zhuǎn)5周，捻轉(zhuǎn)末用血管夾夾持針柄與皮膚，5min/次，隔日一次，共刺激10d，于末次刺激次日取材，取材后制作鋪片。熒光雙染后利用相差顯微鏡獲取鋪片圖像。 2、免疫組織化學方法觀察ERK1/2和P38在筋膜和脊髓中的表達。實驗動物如上（資料與方法1），選取空白對照組、手針后三里組、電針后三里組，手針非穴位

6、組等4組動物，處理方法如上，淺筋膜及脊髓取材后，分別制作2張防脫石蠟切片，利用S-P法進行免疫組化染色。利用Olympus圖像采集系統(tǒng)采取圖像，并用Imagepro-plus6.0進行圖像分析，以平均光密度值（MD，Mean Density）作為比較指標，SPSS13.0軟件包對統(tǒng)計結(jié)果進行分析。 3、Western-Blot檢測在ERK1/2在淺筋膜中的含量和與表達與針刺后時間關系。18只SD大鼠，隨機分為6組，其中對照組3只

7、，針刺1、2、3、4、5組各3只。針刺各組在大鼠腹股溝區(qū)給予電針治療后，分別在針刺后0h、1h、6h、12h和36h等5個時間點取以針刺點為圓心，直徑約1.5cm處的淺筋膜，對照組也在針刺點相應的部位和后三里穴區(qū)取材。取材后利用凱基全蛋白提取試劑盒、凱基BCA蛋白含量檢測試劑盒分別對組織進行提取和定量，Western-blot檢測各組的ERK1/2及p-ERK1/2的表達情況，利用ECL發(fā)光試劑盒顯色，Kodak Image Stati

8、on2000 MM成像系統(tǒng)采集圖像，采用圖像處理軟件Image Tool3.0測定并分析條帶灰度值以檢測ERK的表達水平，利用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包比較各個針刺時間點以及非穴和后三里穴區(qū)的ERK表達情況，統(tǒng)計方法分別采用One-Way ANOVA方差分析和兩獨立樣本t檢驗。 4、Western-Blot觀察ERK1/2和P38在筋膜和脊髓中的表達含量。材料：凱基全蛋白提取試劑盒、凱基BCA蛋白含量檢測試劑盒兔多抗ERK1/2

9、、鼠單抗p-ERK一抗、兔多抗P38、β-actin、PVDF膜以及免疫印跡化學發(fā)光試劑盒均購自美國Santa Cruz公司。辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG和辣根酶標記山羊抗鼠的抗體；SABC（兔抗IgG）-AP試劑盒和SABC（小鼠IgG）-AP試劑盒購自武漢博士德生物公司，組織勻漿器（德國FLUKO公司，超細勻漿器），BIO-RAD半干轉(zhuǎn)膜儀購自Bio-Rad公司。實驗動物與分組同材料與方法1?？瞻讓φ战M、手針后三里組、電針后三里

10、組，手針非穴位組等4組動物處理后，取針刺點局部筋膜和肌肉，經(jīng)蛋白提取和定量后，用Western-blot檢測各組的ERK1/2、p-ERK1/2及P38的表達情況，利用SPSS軟件包對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計方法采用One-Way ANOVA方差分析對各組間ERK1/2、p-ERK1/2和P38的表達情況進行分析。 結(jié)果: 1、針刺后淺筋膜中纖維排列較對照組更為規(guī)則；組織細胞核形態(tài)發(fā)生改變，由原來的圓形或橢圓形變?yōu)楸馑?/p>

11、形或長條狀，而電針后淺筋膜中纖維排列順序和細胞核形態(tài)改變并不典型，熒光雙染發(fā)現(xiàn)牽拉引起胞外基質(zhì)變形、纖維緊張并與拉力方向平行排列，細胞骨架重構成“扁梭形”、胞漿縱軸長而致密、細胞突起界限不清，胞核小、呈長梭形，對照組大量細胞雜亂無序填充在纖維網(wǎng)格內(nèi)、單位面積內(nèi)細胞密度較小、細胞分界清晰，胞內(nèi)骨架伸展成“片狀”、多突起并相互形成聯(lián)系，胞核近似圓形位于胞漿中心。針刺前后脊髓未見明顯形態(tài)學改變。 2、光鏡下觀察，大鼠脊髓背角ERK1/

12、2免疫組化反應顯色呈棕黃色，陽性細胞分布于脊髓灰質(zhì)神經(jīng)元集中的部位，針刺后深染部位向胞核集中。在淺筋膜中，ERK1/2和P38陽性染色區(qū)域多集中在成纖維細胞或巨噬細胞核周圍，P38染色較ERK1/2淡，空白對照組染色較弱，其他各組針刺后有一定程度增加，但以手針非穴位組增加明顯。對各組MD進行統(tǒng)計分析顯示，處理各組治療后淺筋膜的ERK1/2和P38與對照組相比均有一定增加（P<0.05），均以手針非穴位組增加顯著。但脊髓的ERK1/2和P

13、38變化情況與筋膜并不完全一致，手針后三里組和手針非穴位組ERK1/2在大鼠脊髓中的表達針刺后有減弱趨勢。 3、非穴與后三里穴淺筋膜層的ERK和磷酸化ERK的表達情況均未見明顯差異（均P>0.0）。針刺后各組針刺側(cè)的ERK1/2的表達均顯著高于自身對照側(cè)（均P>0.05）。針刺后0h、1h、6h、12 h ERK1的表達水平逐漸增高，12 h達最高，36 h在逐漸回落，但針刺后各個時間點ERK2以及針刺對照側(cè)的ERK1/2表達并

14、不完全按這個趨勢，約在針刺后6h達到高峰。 4、各組針刺后ERK1/2、P-ERK1/2和P38的表達都有明顯提高，且各組間蛋白表達均有顯著性差異（P<0.05）。One-way ANOVA分析顯示，與對照組相比，ERK1/2、p-ERK1/2與P38在筋膜和肌肉中的表達以針刺非穴組增加最為顯著（均P<0.05），其次是電針后三里組和針刺后三里組。 結(jié)論: 1、牽拉引起筋膜結(jié)締組織胞外基質(zhì)變形、纖維緊張并與拉力方

15、向平行排列，針刺使胞核由原來的圓形或橢圓形變?yōu)楸馑笮位蜷L條狀，而電針后淺筋膜中纖維排列順序和細胞核形態(tài)改變并不典型，提示針刺作為一種機械應力主要通過捻轉(zhuǎn)、提插等手法使局部的結(jié)締組織纏繞針體進而發(fā)生組織學形變的?；隗w外培養(yǎng)的細胞的證據(jù)，這些形態(tài)學改變很大程度上伴隨著重要的細胞信號的修復，基因表達和基質(zhì)黏附，所以，這些組織學變化為幫助我們進一步理解各種各樣的機械療法（物理治療，推拿和針灸等）的治療機理提供了一把鑰匙。 2、免疫組化

16、結(jié)果說明：針刺無論是對于非穴和穴位局部筋膜中的ERK1/2和P38表達均有上調(diào)作用，且以手針非穴位組增加明顯，這可能因為非穴針刺點皮下筋膜結(jié)締組織非常豐富，針刺入皮下捻轉(zhuǎn)，能夠帶動較大范圍的結(jié)締組織，產(chǎn)生很強的沉緊感，而后三里穴區(qū)皮下筋膜相對較少，捻轉(zhuǎn)針體只能帶動較少的結(jié)締組織。陽性染色區(qū)域在脊髓中的移位，說明針刺對這種信號蛋白的活化作用。但ERK1/2和P38在脊髓中的表達與在筋膜中并不完全一致，從一個側(cè)面證實針灸對人體的影響除了神經(jīng)

17、-體液等調(diào)節(jié)以外，筋膜結(jié)締組織支架的存在可能構成另外一個較為原始的調(diào)控網(wǎng)絡。 3、在正常的疏松結(jié)締組織中，ERK細胞信號轉(zhuǎn)導蛋白一直有非磷酸化和磷酸化的表達，而這種表達又與細胞的增值和分化有關。這表明從發(fā)育生物學角度由中胚層發(fā)育來的非常古老的疏松結(jié)締組織結(jié)構，在生命個體的新陳代謝中，一直發(fā)揮著活躍的、積極的作用。而從細胞信號轉(zhuǎn)導的角度，穴區(qū)的淺筋膜與非穴區(qū)尚未發(fā)現(xiàn)有明顯的差別。 4、免疫印跡結(jié)果利用信號蛋白半定量的手段進