MAPK信號通路在NO介導(dǎo)的脊髓繼發(fā)性損傷中的作用.pdf

1、急性外傷性脊髓損傷過程中往往伴有神經(jīng)系統(tǒng)的炎性反應(yīng)，表現(xiàn)為內(nèi)源性膠質(zhì)細胞的活化，外周炎性細胞在損傷區(qū)局部的浸潤，以及損傷區(qū)局部各種細胞因子、化學因子的合成。諸如此類的反應(yīng)在急性外傷性脊髓損傷的繼發(fā)性損害的病理機制中扮演著十分重要的角色。 一氧化氮(nitricoxide,NO)是脊髓損傷后的組織代謝產(chǎn)物之一，其合成有賴于誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase，iNOS)的催化。NO在脊髓損傷

2、后病理發(fā)展過程中的作用越來越受到重視，對其合成、作用及清除的機制進行深入研究，將有助于開拓臨床工作者治療脊髓損傷的思路，為減輕脊髓繼發(fā)性損傷，改善預(yù)后帶來新的希望。 NO以L-精氨酸為底物在NOS的催化下合成，半衰期極短，不易直接定量研究，故常以NOS活性來間接反映其生成情況。然而，有關(guān)NO還有許多空白有待研究者們?nèi)ヌ钛a。到目前為止，損傷后iNOS表達的確切機制尚未闡明，表現(xiàn)在對于脊髓損傷后損傷區(qū)附近iNOS表達的在體研究很少，

3、對于iNOS表達的時空規(guī)律的描述也有欠系統(tǒng)；其次，雖然關(guān)于iNOS與細胞凋亡之間關(guān)系的研究已經(jīng)較為深入，但是有關(guān)其與神經(jīng)元變性、細胞壞死之間的關(guān)聯(lián)還鮮見報道；再則，對于脊髓損傷區(qū)MAPK通路的活化現(xiàn)象，大多數(shù)研究者都是著眼于將其與痛敏反應(yīng)的形成聯(lián)系在一起，對于MAPK在前炎性細胞因子生成中的作用研究僅偶見，而其在iNOS生成中的作用研究則完全是空白；最后，還從未有將MAPK激酶的抑制劑作為工具藥在脊髓損傷后給予治療實驗的報道。

4、本論文以探索上述問題為出發(fā)點，以T10節(jié)段脊髓全橫斷的大鼠為研究對象，借助多種技術(shù)手段，對上述問題逐一進行了研究。本研究分為四個實驗： 1.用免疫組織化學、免疫熒光雙標記、Westernblot以及RT-PCR技術(shù)，觀察了SCI后小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞的活化、iNOS蛋白和mRNA的表達變化和細胞定位； 2.利用NOS抑制劑L-NAME，觀察了NO對于神經(jīng)元凋亡、壞死的誘導(dǎo)作用； 3.用Westernblot和免疫

5、熒光雙標記的方法觀察了MAPK家族中的P-ERK1/2、P-p38、P-JNK的在脊髓損傷后的時程變化趨勢以及P-ERK1/2、P-p38的細胞定位；并借助ERK1/2和p38的抑制劑在SCI前預(yù)處理觀察這些MAPK信號通路對于iNOS生成以及損傷區(qū)神經(jīng)元凋亡、壞死的影響。 4.在SCI后30min和90min給予ERK1/2和p38的抑制劑，模擬臨床治療模式，觀察對iNOS生成以及損傷區(qū)神經(jīng)元凋亡、壞死的影響。 本研究

6、的主要結(jié)果有： 1.脊髓全橫斷后小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞早在傷后1h即發(fā)生活化。iNOS陽性細胞出現(xiàn)在傷后3h至24h的脊髓灰質(zhì)內(nèi)，主要為小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞。iNOS的蛋白量在損傷后3h開始明顯上調(diào)，在6h達到高峰，到24h開始下降，直到72h才返回到基礎(chǔ)水平。iNOSmRNA水平亦在術(shù)后1h開始升高，在損傷后6h達到高峰，直到72h才返回到基礎(chǔ)水平。 2.脊髓全橫斷前給予NOS抑制劑L-NAME可以使脊髓全橫斷后24h時

7、的凋亡細胞百分比顯著性減少，同時使脊髓全橫斷后7d的NeuN染色陽性的神經(jīng)元數(shù)量回升。 3.脊髓全橫斷誘導(dǎo)了損傷區(qū)附近組織內(nèi)P-ERK1/2和P-p38的表達上調(diào)，而P-JNK水平變化不明顯。脊髓全橫斷后6h的共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，ERK1/2和p38的磷酸化現(xiàn)象見于脊髓損傷區(qū)附近灰質(zhì)的小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞內(nèi)，而星形膠質(zhì)細胞的標記物GFAP與這兩種激酶均不雙標。脊髓全橫斷前30min給予PD98059和SB203580分別抑制了

8、ERK1/2和p38的活性，都可以使SCI后24h時的凋亡細胞百分比減少，SB203580的抑制效力更為顯著。同樣預(yù)處理觀察脊髓全橫斷后7d的NeuN陽性細胞數(shù)量回升情況的結(jié)果顯示，PD98059組與單純脊髓損傷組間不存在統(tǒng)計學差異，而SB203580組與單純脊髓損傷組相比差異顯著。 4.脊髓全橫斷后30min給予PD98059可一定程度下調(diào)iNOSmRNA水平，而90min組無此作用。而30min和90min給予的SB2035

9、80都能夠顯著地下調(diào)iNOSmRNA水平。兩個時間點給予的PD98059都不能減輕凋亡的發(fā)生和增加神經(jīng)元的存活；反之，同樣時間點給予的SB203580都能夠顯著地減少凋亡發(fā)生，增加神經(jīng)元的存活，其中30min給藥的效果優(yōu)于90min。 本研究的結(jié)論為： 1.大鼠脊髓全橫斷損傷后，活化的小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞是NO生成的主要來源； 2.由iNOS合成的NO是SCI過程中造成繼發(fā)性神經(jīng)元凋亡壞死的重要因素； 3