TWEAK-P38MAPK信號(hào)通路在狼瘡腎炎發(fā)病機(jī)制中的作用研究.pdf

1、研究背景：
　　 系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種常見(jiàn)的自身免疫性疾病，狼瘡腎炎(Lupus nephritis，LN)是系統(tǒng)性紅斑狼瘡最常見(jiàn)也是最嚴(yán)重的臨床病癥之一，其中50％SLE患者有臨床腎炎表現(xiàn)，而腎臟病理活檢有腎臟病變者幾乎達(dá)100％。免疫功能紊亂是導(dǎo)致狼瘡腎炎發(fā)病的核心機(jī)制，淋巴細(xì)胞活化異常，尤其是T淋巴細(xì)胞活化異常是免疫功能紊亂的樞紐。免疫系統(tǒng)的紊亂最終導(dǎo)致B

2、淋巴細(xì)胞的多克隆活化，產(chǎn)生多種自身抗體，從而導(dǎo)致多種組織器官功能損害。
　　 已有研究證明，某些細(xì)胞因子，如MCP-1與IL-10，可刺激淋巴細(xì)胞的活化，誘導(dǎo)自身抗體的產(chǎn)生及免疫紊亂，促使炎癥細(xì)胞腎組織浸潤(rùn)等，參與SLE患者腎損害的發(fā)生，SLE患者血清MCP-1與IL-10表達(dá)異常提示SLE病情活躍。研究證實(shí)，多種信號(hào)通路參與二者的調(diào)控，如NF-kB信號(hào)通路。P38 MAPK(mitogen-activated proteink

3、inase)是NF-kB信號(hào)通路的上游炎性調(diào)控因子。國(guó)內(nèi)外研究已經(jīng)證實(shí)，狼瘡腎炎小鼠腎組織p38 MAPK表達(dá)明顯增加，p38 MAPK是狼瘡腎炎發(fā)病的重要信號(hào)通路之一。在多種動(dòng)物模型及細(xì)胞的研究中均發(fā)現(xiàn)，如人類(lèi)單核巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞以及外周血單一核細(xì)胞，糖尿病大鼠及支氣管哮喘動(dòng)物模型等，P38 MAPK參與調(diào)控IL-10及MCP-1的表達(dá)。
　　 基于上述研究基礎(chǔ)及理論支持，本研究擬通過(guò)體內(nèi)、外研究，分子生物學(xué)等實(shí)驗(yàn)方法，探

4、討下列幾個(gè)問(wèn)題：
　　 1.SLE患者外周血PBMC TWEAK表達(dá)情況以及TWEAK表達(dá)與SLE疾病活動(dòng)性和腎損害的相關(guān)性研究。
　　 2.分析體外培養(yǎng)LN患者PBMC的TWEAK的表達(dá)及TWEAK-P38MAPK-MCP-1、IL-10信號(hào)通路在LN發(fā)病中的作用。
　　 3.檢測(cè)MRL/lpr小鼠模型腎臟組織TWEAK的表達(dá)狀況，采用TWEAK-siRNA基因沉默技術(shù)，探討TWEAK siRNA對(duì)狼瘡腎炎小鼠

5、模型腎損害的靶向治療作用。
　　 一.系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TWEAK表達(dá)及其意義。
　　 方法：
　　 研究對(duì)象包含SLE患者48例，其中LN患者25例，另選年齡、性別相當(dāng)?shù)念?lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者20例及健康志愿者15例作對(duì)照。SLE和RA的診斷均符合1997年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)。LN患者經(jīng)腎活檢證實(shí)全部有腎臟損害表現(xiàn)，持續(xù)性蛋白尿超過(guò)0.5g/24h或有細(xì)胞管型。采用RT-PCR、West

6、ern印跡及免疫熒光等方法分別在基因及蛋白質(zhì)表達(dá)水平上檢測(cè)SLE患者PBMC的TWEAK表達(dá)，同時(shí)對(duì)該48例SLE患者疾病活動(dòng)度進(jìn)行SLEDAI評(píng)分。ELISA方法檢測(cè)血清IL-10及MCP-1的含量。分析TWEAK表達(dá)與血清IL-10、MCP-1和SLE疾病病情活動(dòng)程度臨床指標(biāo)(血清抗雙鏈DNA抗體，補(bǔ)體C3、C4，免疫球蛋白IgG、IgA、IgM，尿蛋白)的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：
　　 TWEAK在SLE患者PBMC

7、中mRNA表達(dá)明顯高于RA患者及正常健康志愿者，(P<0.01)，Western印跡顯示TWEAK蛋白水平的表達(dá)與mRNA水平相似，SLE患者PBMC中TWEAK蛋白表達(dá)明顯高于RA患者及正常健康志愿者。與SLE無(wú)腎損害患者相比，LN患者PBMC中TWEAK mRNA及蛋白表達(dá)均明顯高于非腎炎組患者(P<0.01)。免疫熒光結(jié)果顯示TWEAK在SLE患者PBMC胞漿內(nèi)高表達(dá)。SLE患者血清IL-10及MCP-1濃度明顯高于RA患者及正常

8、健康志愿者，TWEAK表達(dá)與SLEDAI、尿蛋白、血清抗雙鏈DNA抗體、IL-10及MCP-1成正相關(guān)，與血清補(bǔ)體C3、C4含量成負(fù)相關(guān)，與免疫球蛋白水平無(wú)明顯相關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1.SLE患者PBMC中TWEAK表達(dá)升高，其中LN患者升高更明顯。
　　 2.PBMC中TWEAK表達(dá)水平明顯升高與SLE活動(dòng)指標(biāo)呈正相關(guān)，提示TWEAK可作為SLE疾病活動(dòng)程度指標(biāo)之一，且可能在SLE腎臟損害中起著重要的作用

9、。
　　 二.狼瘡腎炎患者外周血單一核細(xì)胞TWEAK表達(dá)意義及其對(duì)P38 MAPK信號(hào)通路的影響。
　　 方法：
　　 研究對(duì)象包括42例SLE患者和20名健康對(duì)照者，將SLE患者分為腎炎組(LN：26例)和非腎炎組(NRSLE：16例)。另選正常健康患者20例做為正常對(duì)照。SLE診斷符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，LN患者經(jīng)腎活檢證實(shí)全部有腎臟損害表現(xiàn)，持續(xù)性蛋白尿超過(guò)0.5g/24h或有細(xì)胞管型。梯度離心法制備新

10、鮮外周血單一核細(xì)胞(PBMC)，分成5組。A組：?jiǎn)渭兣囵B(yǎng)組(不加任何刺激物，單純1640培養(yǎng)基)，B組：A+TWEAK-中和性抗體組；C組：A+SB203580組(特異性P38MAPK阻斷劑)；D組：PHA/PMA刺激組；E組：D+TWEAK-中和性抗體組；F組：D+SB203580組(特異性P38MAPK阻斷劑)，每孔加入細(xì)胞1×106，加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后收集細(xì)胞，采取RT-PCR，Western Blot及

11、免疫熒光分別在mRNA及蛋白表達(dá)水平上檢測(cè)TWEAK及P38MAPK的表達(dá)。ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液的IL-10，MCP-1和抗雙鏈DNA水平。
　　 結(jié)果：
　　 SLE患者體外培養(yǎng)PBMC的TWEAK和P38 MAPK的蛋白表達(dá)均明顯高于健康對(duì)照組，LN組TWEAK表達(dá)明顯高于NRSLE。Western印跡顯示PHA/PMA刺激可上調(diào)PBMC中TWEAK和P38MAPK蛋白表達(dá)。TWEAK-中和性抗體明顯下調(diào)T

12、WEAK和P38MAPK的表達(dá)，使細(xì)胞培養(yǎng)上清液抗雙鏈DNA抗體和IL-10水平下調(diào)。p38 MAPK的抑制劑SB203580可下調(diào)PBMC的p38 MAPK表達(dá)，使細(xì)胞培養(yǎng)上清液抗雙鏈DNA抗體、IL-10和MCP-1水平下調(diào)，但對(duì)TWEAK蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響。
　　 結(jié)論：
　　 TWEAK可能通過(guò)激活P38 MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)LN患者PBMC中IL-10和MCP-1的表達(dá)上調(diào)參與狼瘡腎炎的發(fā)病。
　　 三

13、.TWEAK-siRNA對(duì)MRL/lpr狼瘡小鼠腎保護(hù)作用及機(jī)制研究。
　　 方法：
　　 12周齡雌性MRL/lpr狼瘡小鼠隨機(jī)分為4組：A組(未干預(yù)組，n=9)；B組(脂質(zhì)體組)(n=9)；C組：(陰性對(duì)照siRNA組，n=9)；D組(TWEAK-siRNA干擾組，n=9)。另有9只C57BL/6J小鼠被列入為正常對(duì)照組(E組)。將siRNA預(yù)混于含DOTAP的溶劑中，采取1mg/kgsiRNA尾靜脈流體注射法于C、

14、D兩組小鼠，每周1次。采用RT-PCR及Western blot技術(shù)檢測(cè)TWEAK和p38 mRNA及蛋白水平，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)法檢測(cè)血清抗dsDNA抗體和抗核抗體(ANA)，IgG，IgM水平，留尿測(cè)24小時(shí)尿蛋白，采用直接免疫熒光法及HE、PAS、Masson染色病理切片檢測(cè)小鼠腎臟損害情況。RT-PCR方法檢測(cè)腎組織IL-10和MCP-1的含量。
　　 結(jié)果：
　　 C57BL/6J小鼠腎組織可見(jiàn)腎小管

15、少量TWEAK及P38 MAPK蛋白表達(dá)，與C57BL/6J小鼠相比，MRL/lpr各組小鼠24小時(shí)尿蛋白、血清抗dsDNA抗體，IgG和IgM水平明顯升高，腎組織腎小管、腎小球系膜區(qū)及血管內(nèi)皮可見(jiàn)較多TWEAK及P38 MAPK蛋白表達(dá)。與陰性對(duì)照siRNA組，脂質(zhì)體注射組，及未干預(yù)組比較，TWEAK-siRNA干預(yù)組小鼠腎組織TWEAK、P38 MAPK mRNA及蛋白表達(dá)水平下降，血清抗dsDNA抗體水平、IgG和IgM水平均降低

16、，IL-10 mRNA及MCP-1 mRNA水平下調(diào)，腎臟病理?yè)p害及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，同時(shí)，尿蛋白也較前減少。
　　 結(jié)論：
　　 MRL/lpr狼瘡腎炎小鼠模型中TWEAK表達(dá)明顯增高，TWEAKsiRNA可有效阻斷TWEAK-P38 MAPK-IL-10、MCP-1信號(hào)通路，TWEAK有望作為未來(lái)靶基因的治療目標(biāo)。
　　 從以上三部分實(shí)驗(yàn)我們總結(jié)如下：
　　 1.SLE患者TWEAK水平可作為SL