Stat3信號傳導(dǎo)通路在喉癌中的作用及其分子機(jī)制.pdf

1、為探討Stat3信號通路在喉鱗癌發(fā)生發(fā)展和浸潤轉(zhuǎn)移中的分子機(jī)制，為喉癌的基因治療篩選理想的靶目標(biāo)，本研究在喉鱗癌組織和喉鱗癌細(xì)胞系Hep-2中利用免疫組化技術(shù)、Western Blot、MTT及流式細(xì)胞技術(shù)等方法探討了喉鱗癌中Stat3信號通路的激活狀態(tài)及其臨床意義，從不同側(cè)面了解Stat3與喉癌生物學(xué)行為和化療抵抗關(guān)系及其機(jī)理。其中包括探討喉癌組織中Star3蛋白表達(dá)水平的臨床意義，總結(jié)Stag是否可作為喉癌早期診斷、術(shù)前輔助診斷和病

2、情監(jiān)測標(biāo)記物；應(yīng)用Stat3反義寡核苷酸技術(shù)轉(zhuǎn)染人喉癌細(xì)胞系后，研究喉癌細(xì)胞增殖水平隨時(shí)間延長和濃度的關(guān)系；喉癌細(xì)胞周期停滯Stat3蛋白表達(dá)與活性是否下調(diào)，與CyclinD1、CyclinE及CDK2、CDK4、CDK6蛋白表達(dá)的關(guān)系，G<,1>期細(xì)胞和S期細(xì)胞的比率，探討Stat3信號傳導(dǎo)通路對喉癌細(xì)胞G<,1>～S期調(diào)控的可能機(jī)制；利用干擾技術(shù)阻斷喉鱗癌細(xì)胞中活化的Stat3信號通路后，探討對喉鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響等及在減低喉

3、癌化療抵抗和增強(qiáng)其對化療藥物DDP敏感性的可能性。因此，Stat3信號傳導(dǎo)通路與細(xì)胞周期調(diào)控的研究對于癌基因Stat3靶向性治療腫瘤具有重要意義，探討抑制Stat3生成在減低喉癌化療抵抗和增強(qiáng)其對化療敏感性的可能性為研究發(fā)現(xiàn)高效、低毒的抗癌藥物及設(shè)計(jì)新的聯(lián)合治療方案提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，本研究的完成對進(jìn)一步探討喉癌的發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移機(jī)制，揭示以Stat3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為靶點(diǎn)在喉癌治療中的作用和作用機(jī)制，增強(qiáng)頭頸腫瘤患者的綜合治療效果和改善預(yù)

4、后都具有較大理論和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。 本實(shí)驗(yàn)分為以下三部分： 第一部分 Stat3信號傳導(dǎo)通路在喉癌中的組成性激活及其與喉鱗癌生物學(xué)行為的關(guān)系 目的：觀察JAK-Stat途徑中Stat3、p-Stat3、Cyclin D1與Bcl-x1蛋白在喉癌組織和喉癌細(xì)胞系中的表達(dá)及相互關(guān)系，探討Stat3信號傳導(dǎo)通路在喉癌中的組成性激活與喉癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系。 方法 1 采用免疫組化SP技術(shù)檢測50例

5、喉鱗癌組織及其相應(yīng)的癌旁正常喉黏膜組織和喉癌細(xì)胞系Hep-2中Stat3和磷酸化Stat3(p-Stat3)蛋白的表達(dá)。 2 采用Western-blot技術(shù)檢測50例喉鱗癌組織及其相應(yīng)的癌旁正常喉黏膜組織和喉癌細(xì)胞系Hep-2中Stat3、p-Stat3蛋白及其下游靶基因產(chǎn)物Cyclin D1、Bcl-x1蛋白的表達(dá)。 第二部分 Stat3信號傳導(dǎo)通路對喉癌細(xì)胞G1-S期的調(diào)控 目的：應(yīng)用Stat3反義寡核苷酸

6、技術(shù)轉(zhuǎn)染人喉癌細(xì)胞系后，研究喉癌細(xì)胞周期停滯對Stat3蛋白表達(dá)與活性的影響以及和CDK、CDI之間的關(guān)系，探討Stat3信號傳導(dǎo)通路對喉癌細(xì)胞G<,1>～S期調(diào)控的可能機(jī)制。 方法 1 用Stat3正義寡核苷酸和Stat3反義寡核苷酸用脂質(zhì)體Lipofectamine2000包裹轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞，作為轉(zhuǎn)染組細(xì)胞。將脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為未轉(zhuǎn)染組(對照組)細(xì)胞。 2 MTT法檢測不同濃度(100、150、200、

7、300、400 nmol/L)Stat3 AS-ON、Stat3 S-ON對轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組Hep-2細(xì)胞作用24h、48h及72h后細(xì)胞的增殖情況。 3 流式細(xì)胞技術(shù)檢測加入Stat3 AS-ON、Stat3 S-ON至終濃度200 nmol/L作用24h、48h及72h后細(xì)胞周期情況。 4 Westem Blot法檢測轉(zhuǎn)染Stat3反義寡核苷酸72h后，Hep-2細(xì)胞的細(xì)胞周期素CyclinD1、CyclinE與細(xì)胞

8、周期素依賴性激酶CDK2、CDK4、CDK6；以及細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子p21、p27的蛋白表達(dá)水平。 第三部分 Stat3反義寡核苷酸聯(lián)合化療調(diào)控喉癌細(xì)胞增殖與凋亡分子機(jī)制的研究 目的：利用反義寡核苷酸干擾技術(shù)阻斷喉癌細(xì)胞系Hep-2中活化的Stat3信號通路后，探討對喉鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響等及在減低喉癌化療抵抗和增強(qiáng)其對化療藥物DDP敏感性的可能性。 方法 1 用Stat3正義寡核苷酸和St

9、at3反義寡核苷酸用脂質(zhì)體Lipofectamine2000包裹轉(zhuǎn)染喉癌細(xì)胞系Hep-2細(xì)胞，作為轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，分為Stat3 S-ON組、Stat3 AS-ON組、DDP組、DDP+Stat3 AS-ON組；將脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為未轉(zhuǎn)染組(對照組)細(xì)胞；Hep-2細(xì)胞加無血清培養(yǎng)基為空白對照組。 2 MTT法檢測不同濃度(100、150、200、300、400 nmol/L)Stat3 AS-ON、Stat3 S-ON，以及DD

10、P(最終質(zhì)量濃度4 μg/ml)對轉(zhuǎn)染組及對照組Hep-2細(xì)胞作用后0h、24h、48h及72h的細(xì)胞增殖情況。 3 流式細(xì)胞技術(shù)檢測Stat3 AS-ON、Stat3 S-ON至終濃度200nmol/L，以及DDP至最終質(zhì)量濃度為4 μg/ml作用轉(zhuǎn)染組及對照組Hep-2細(xì)胞后0h、24h、48h及72h的細(xì)胞周期變化情況。 4 流式細(xì)胞技術(shù)檢測Stat3 AS-ON、Stat3 S-ON至終濃度200 nmol/L，

11、以及DDP至最終質(zhì)量濃度為4μg/ml作用轉(zhuǎn)染組及對照組Hep-2細(xì)胞后0h、24h、48h及72h的細(xì)胞凋亡情況。 5 Westem Blot法檢測Stat3 AS-ON、Star3 S-ON至終濃度200 nmol/L，以及DDP至最終質(zhì)量濃度為4μg/ml作用轉(zhuǎn)染組及對照組Hep-2細(xì)胞72h后Stat3、p-Stat3及其靶基因產(chǎn)物Bcl-x1、CyclinD1的蛋白表達(dá)水平。 第四部分 JAK激酶抑制劑AG49

12、0聯(lián)合化療抑制喉癌細(xì)胞Stat3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究 目的：利用JAK-Stat途徑特異性抑制劑AG490作用于喉癌細(xì)胞系Hep-2細(xì)胞株，并與DDP聯(lián)合應(yīng)用，研究信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑及化療對腫瘤細(xì)胞的影響，探討Stat3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在藥物治療喉癌中的作用。 方法 1 用JAK激酶抑制劑AG490及DDP分別或聯(lián)合作用于喉癌細(xì)胞系Hep-2為試驗(yàn)組，分為AG490組、DDP+AG490組及DDP組；Hep-2細(xì)胞加無血清

13、培養(yǎng)基為空白對照組。 2 MTT法檢測試驗(yàn)組分別加入AG490和/或DDP后0h、24h、48h及72h細(xì)胞的增殖情況。 3 流式細(xì)胞技術(shù)檢測試驗(yàn)組分別加入AG490和/或DDP后0h、24h、48h及72h的細(xì)胞周期情況。 4 流式細(xì)胞技術(shù)檢測試驗(yàn)組分別加入AG490和/或DDP后0h、24h、48h及72h的細(xì)胞凋亡情況。 5 Western Blotting法檢測AG490和/或DDP作用于喉癌細(xì)胞

14、系Hep-2細(xì)胞72h后Stat3、P-Stat3及其靶基因產(chǎn)物Bcl-x1、CyclinD1的蛋白表達(dá)水平。 結(jié)論 1. 首次在喉鱗癌組織及細(xì)胞系中對Stat3信號通路的激活情況進(jìn)行檢測，從蛋白水平、定位及定量表達(dá)、基因水平表達(dá)等不同側(cè)面研究證實(shí)了在喉鱗癌中存在著組成性激活的Stat3信號通路。 2.喉鱗癌組織和正常喉粘膜組織中Stat3蛋白及p-Stat3蛋白的表達(dá)有差異，p-StaG的表達(dá)具有異質(zhì)性，p-S

15、tat3在癌細(xì)胞中異常激活具有不同步性。Stat3與p-StaG蛋白的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤T分級、腫瘤部位無關(guān)，但與腫瘤組織的分化程度、臨床分期和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。Bcl-x1蛋白的表達(dá)情況同腫瘤的分化水平相關(guān)，在分化降低的過程中Bcl-x1有下調(diào)的趨勢，表明激活的Stat3信號通路在喉鱗癌發(fā)生、發(fā)展以及浸潤轉(zhuǎn)移中起著一定的作用。 3.利用反義干擾技術(shù)，能高效特異地阻斷Star3信號通路的組成性激活，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋

16、亡，使細(xì)胞周期停滯，抑制喉鱗癌細(xì)胞的增殖，表明Stat3信號傳導(dǎo)通路對于喉癌細(xì)胞G1～S期起著重要的調(diào)控作用，通過調(diào)節(jié)CDK/Cyclin復(fù)合物與CKI成員之間的平衡而調(diào)節(jié)喉癌細(xì)胞異常增殖，介導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。提示活化的Star3信號通路是喉癌基因治療中一個(gè)理想分子靶點(diǎn)。 4．JAK激酶抑制劑阻斷Stat3信號通路以后，腫瘤細(xì)胞中Stat3下游抗凋亡基因Bcl-x1與CyclinD1的表達(dá)也受到阻斷，細(xì)胞發(fā)生凋亡，Bcl-x1蛋白

17、表達(dá)水平在AG490作用后逐漸降低，細(xì)胞凋亡明顯增加，表明AG490對Hep-2細(xì)胞的促凋亡作用和JAK-Stat3-Bcl-x1途徑有關(guān)。 5．阻斷Stat3信號通路的組成性激活，惡變轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生存和生長對Stat3信號途徑呈不可逆的依賴，提示喉癌細(xì)胞耐藥可能與Stat3異常激活有關(guān)；AG490能夠增加腫瘤細(xì)胞對化療藥物DDP的敏感性，二者產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤作用。 6．反義Stat3不能夠完全抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，對細(xì)胞凋亡