巨噬細胞STAT3信號途徑在誘導(dǎo)乳腺癌免疫耐受中的作用.pdf

1、在惡性腫瘤微環(huán)境中，TAMs誘導(dǎo)免疫抑制、分泌促進腫瘤增殖和浸潤的細胞因子、生長因子而促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。但是具有抗腫瘤免疫作用的巨噬細胞轉(zhuǎn)化為促腫瘤作用的TAMs的機制還不清楚。最近的研究表明，STAT家族成員之一STAT3是炎性反應(yīng)的負性調(diào)節(jié)因子，巨噬細胞STAT3基因特異性敲出的小鼠不產(chǎn)生對移植腫瘤的免疫耐受。我們選擇STAT3作為切入點，從分子水平探討TAMs的STAT3信號途徑在誘導(dǎo)機體對乳腺癌發(fā)生免疫耐受中的作用和機制。實

2、驗從三個方面進行研究，主要方法、結(jié)果及結(jié)論如下： 1用免疫組化方法檢測人乳腺癌標本中TAMs和STAT3陽性的TAMs的浸潤密度，ILISA檢測乳腺癌標本中的細胞因子IL．12、IL．1B、TNF-II、TGF-p含量，分析TAMs、STAT3陽性的TAMs浸潤密度與腫瘤局部細胞因子IL-12、IL一1p、TNF-(I、TGF-p水平以及與臨床預(yù)后指標之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)STAT3陽性的TAMs浸潤程度與局部免疫激活性細胞因子I

3、Ll2水平呈負相關(guān)，與免疫抑制和促腫瘤性細胞因子IL一1p、rNF-o[、TGF-p的含量呈正相關(guān)、與乳腺癌的部分不良預(yù)后指標呈正相關(guān)，高密度的STAT3陽性的TAMs浸潤是影響無復(fù)發(fā)生存率的然險因素。 2用EMSA檢測STAT3decoyODNs與STAT3蛋白結(jié)合的特異性，免疫熒光法檢測STAT3decoyODNs的轉(zhuǎn)染率，Westernblot檢測STAT3decoyODNs在細胞內(nèi)對STAT3調(diào)控的靶基因表達的抑制效應(yīng)，

4、證實STAT3decoyODNs能特異性地與STAT3蛋白結(jié)合并能被高效率地轉(zhuǎn)染入細胞、在細胞內(nèi)抑制STAT3的活性。用含有人乳腺癌細胞MCF-7的培養(yǎng)上清液的條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)人外周血單核細胞，STAT3decoyODNs轉(zhuǎn)染這些細胞并用細菌的LPS將其激活，檢測單核細胞STAT3的活性，并檢測單核細胞分泌的細胞因子IL一12、IL一1p、TNF-0t、TGF—B產(chǎn)量和這些細胞對腫瘤細胞的直接細胞毒性和抗原呈遞能力；用大鼠乳腺癌細胞的

5、條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)大鼠的腹腔巨噬細胞，STAT3decoyODNs轉(zhuǎn)染這些細胞并用細菌的LPS將其激活，檢測巨噬細胞STAT3的活性，并檢測巨噬細胞分泌的細胞因子IL．12、IL一1p、rNF-a、TGF-13產(chǎn)量和這些細胞對腫瘤細胞的直接細胞毒性和抗原呈遞能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)人乳腺癌細胞MCF-7條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)后，伴隨STAT3的過度激活，誘導(dǎo)的單核細胞分泌的免疫激活性細胞因子IL。12產(chǎn)量下降、免疫抑制和促腫瘤生長性細胞因子IL一1p、

6、TGF-p的產(chǎn)量增加，與對照組比較均有顯著差異；而且單核細胞對腫瘤細胞的細胞毒性和抗原呈遞能力減弱，單核細胞的直接細胞毒性及呈遞腫瘤抗原刺激的淋巴細胞的增殖能力及細胞毒性與對照組比較均有顯著差異。轉(zhuǎn)染STAT3decoyODNs使誘導(dǎo)的單核細胞分泌的免疫激活性細胞因子IL一12產(chǎn)量增加、而免疫抑制和促腫瘤生長性細胞因子IL．1p、TNF-(I、TGF-p的產(chǎn)量減少，與誘導(dǎo)組比較均有顯著差異；并且能增強誘導(dǎo)的單核細胞的直接細胞毒性和抗原呈

7、遞能力，單核細胞的直接細胞毒性及呈遞腫瘤抗原刺激的淋巴細胞的增殖能力及細胞毒性與誘導(dǎo)組比較均有顯著差異。經(jīng)SD大鼠乳腺癌細胞SHZ-88條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)后，伴隨STAT3的過度激活，誘導(dǎo)的SD大鼠的巨噬細胞分泌的IL．12產(chǎn)量下降，IL一1p、TGF—β的產(chǎn)量增加，與對照組比較均有顯著差異；而且對腫瘤細胞的細胞毒性和抗原呈遞能力減弱，巨噬細胞的直接細胞毒活性及呈遞腫瘤抗原刺激的淋巴細胞的增殖能力及細胞毒性與對照組比較均有顯著差異。轉(zhuǎn)染ST

8、AT3decoyODNs使誘導(dǎo)的巨噬細胞分泌的IL．12產(chǎn)量增加，IL一1B、TNF-~、TGF-p的產(chǎn)量減少，與誘導(dǎo)組比較均有顯著差異；并且能增強誘導(dǎo)的巨噬細胞的直接細胞毒活性和抗原呈遞能力，巨噬細胞的細胞毒性及呈遞腫瘤抗原刺激的淋巴細胞的增殖能力及細胞毒性與誘導(dǎo)組比較均有顯著差異。 3將SD大鼠的乳腺癌細胞移植到SD大鼠，然后在腫瘤局部注射乳腺癌細胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的巨噬細胞或轉(zhuǎn)染STAT3decoyODNs的誘導(dǎo)巨噬細胞，檢

9、測腫瘤的生長、乳腺癌標本中的細胞因子IL一1p、TNF-(I、TGF-p、IL一12含量，腫瘤組織中CD3+的淋巴細胞的浸潤密度，腫瘤組織的caspase-3的表達強度，腫瘤細胞的凋亡指數(shù)，大鼠脾T細胞對乳腺癌細胞的毒性和被腫瘤抗原刺激后的IFN-7產(chǎn)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)的巨噬細胞處理組腫瘤生長速度加快，在第24、28、32天腫瘤體積與對照組比較有顯著差異；腫瘤組織中的免疫抑制性和促腫瘤作用的細胞因子IL一1p、TGF-p含量增加，免疫激活

10、性細胞因子IL一12含量減少，與對照組比較有顯著差異；腫瘤組織的淋巴細胞浸潤密度明顯減少，與對照組比較，有顯著差異；腫瘤細胞的caspase-3表達下降，與對照組比較，有顯著差異；腫瘤細胞的凋亡指數(shù)減少，與對照組比較，有顯著差異；大鼠脾T細胞對腫瘤細胞的毒性和被腫瘤抗原刺激后的IFN-7產(chǎn)量明顯下降，與對照組比較，有顯著差異。轉(zhuǎn)染STAT3decoyODNs的誘導(dǎo)巨噬細胞處理組明顯抑制腫瘤的生長，在第20、24、28、32天，腫瘤體積與

11、誘導(dǎo)的巨噬細胞處理組比較有顯著差異；腫瘤組織的免疫抑制性和促腫瘤作用的細胞因子IL-1p、TNF-~、TGF-β含量減少，免疫激活性細胞因子ILl2含量增加，與誘導(dǎo)的巨噬細胞處理組比較有顯著差異；乳腺癌組織中的T淋巴細胞浸潤密度明顯增加，與誘導(dǎo)的巨噬細胞處理組比較有顯著差異；乳腺癌細胞的cacpase-3表達明顯增強，與誘導(dǎo)的巨噬細胞處理組比較有顯著差異；腫瘤細胞的凋亡指數(shù)明顯增加，與誘導(dǎo)的巨噬細胞處理組比較有顯著差異；大鼠脾T細胞對腫