Stat3蛋白提取、抗體制備及其在乳腺癌診斷中的應用.pdf

1、河北醫(yī)科大學碩士學位論文Stat3蛋白提取、抗體制備及其在乳腺癌診斷中的應用姓名：李宏芬申請學位級別：碩士專業(yè)：臨床檢驗診斷學指導教師：單保恩;王俊霞20040301中文摘要M C F ．7 和M D A - M B ．2 3 1S t a r 3 的m R N A 表達情況。檢測乳腺癌組織和正常乳腺S t a t 3 蛋白的m R N A 表達情況。R T - P C R 產物經G e l ．p r o 凝膠分析軟件對電泳譜帶進行半定

2、量分析，用I O D ( i n t e g r a t e d o p t i c a ld e n s i t y ) 表示凝膠譜帶的面積×熒光強度值，s t a t 3 ／1 3 ．a c t i n 比值代表各m R N A 相對表達水平。結果：( 1 ) 蛋白的制備：我們將s t a t 3 重組于粘蟲卵巢細胞( S f 2 1 細胞) ，從2 ．5 ×1 0 9 個S f 2 l 細胞中提取了2 0 0

3、m g S t a t 3蛋自質。為了減少蛋白降解或活性喪失，迅速進行了層析分離。首先經Y e l l o w ．3 層析柱分離，得到含有S t a t 3 蛋白的層析成分，該成分在5 0 ．1 5 0 m m o l ／L 鹽濃度梯度之間被洗脫。蛋白印跡分析結果顯示，蛋白質峰含有S t a t 3 蛋白( 分子量為9 2 K D a ) 。將Y e l l o w ．3 層析分離得到的S t a r 3 成分進一步用T o y o p

4、 e a r l A F ．H e p t i n ．6 5 0 M 層析柱純化，在1 9 ．2 4 層析成分中被分離出來，與理論S t a r 3 的分子量吻合，得到純的S t a t 3 。該成分的N a C l 洗脫液濃度為5 0 ．8 0 m m o l ／L 。經S D S ．P A G E分離，蛋白印跡實驗證實，分子量9 2 K D a 處的蛋白條帶為S t a t 3 。共得到6 ．6 8 m gS t a r 3 ，純度

5、高于9 5 ％。( 2 ) 兔抗S t a t 3抗體的制備及應用：用重組小鼠S t a r 3 蛋白免疫家兔，6 W 檢測后靜脈血中抗S t a t 3 抗體效價> 1 ：2 5 6 ，0 0 0 ( A 4 5 0 = 0 ．4 0 ) 。采取血清并純化S t a t 3 抗體，將S t a t 3 蛋白經S D S —P A G E 分離，可見1 條相對分子質量( M r ) 為9 2 ，0 0 0 的蛋白條帶。用純化的抗S