STAT1在G-CSF誘導(dǎo)異基因造血干細(xì)胞移植供者T細(xì)胞免疫耐受中的作用.pdf

1、目的：臨床實(shí)踐表明應(yīng)用G-CSF作為干細(xì)胞動(dòng)員劑進(jìn)行的外周血造血干細(xì)胞移植，其急性移植物抗宿主反應(yīng)并不比傳統(tǒng)的骨髓移植高。這說(shuō)明G-CSF存在著誘導(dǎo)免疫耐受的作用。G-CSF可以從T細(xì)胞分化、樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）、單個(gè)核細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等角度對(duì)干細(xì)胞移植物的免疫功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，誘導(dǎo)移植物中的T細(xì)胞產(chǎn)生免疫耐受。目前的觀察表明，G-CSF刺激后，出現(xiàn)Th1型細(xì)胞因子（IFN-γ、IL-2、T-bet、IL-12等）明顯減少，而Th2型細(xì)胞

2、因子（IL-10、IL-4、GATA-3等）顯著增多，這一現(xiàn)象在誘導(dǎo)免疫耐受中起著至關(guān)重要的作用。但是，目前對(duì)T細(xì)胞上是否存在G-CSF受體仍存在很大的爭(zhēng)議，因此G-CSF能否直接對(duì)T細(xì)胞產(chǎn)生作用仍不肯定。JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑作為機(jī)體內(nèi)非常重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，在機(jī)體免疫功能的形成與發(fā)揮作用中有重要的作用。這一途徑參與體內(nèi)多種病理生理過(guò)程，調(diào)節(jié)體內(nèi)眾多基因的表達(dá)，約有50余種細(xì)胞因子通過(guò)其進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)。因此，它對(duì)機(jī)體各種生理功

3、能的維持及對(duì)外界刺激做出正確的反應(yīng)是非常重要的一環(huán)。其中，STAT1作為T(mén)h1型細(xì)胞因子重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，在IFN-γ、IL-2引起的基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中居于核心地位。并且很多學(xué)者已經(jīng)證實(shí)STAT1是GVHD重要的調(diào)控點(diǎn)。但到目前為止，尚沒(méi)有研究對(duì)STAT1在G-CSF誘導(dǎo)的免疫耐受中的變化進(jìn)行過(guò)檢測(cè)。因此本實(shí)驗(yàn)在G-CSF誘導(dǎo)免疫耐受過(guò)程中，檢測(cè)Th1型細(xì)胞及Th2型細(xì)胞的數(shù)量及比值，并檢測(cè)G-CSF受體、T-bet、GATA-3和STA

4、T1的表達(dá)水平的變化，并對(duì)其作用進(jìn)行初步探討，以進(jìn)一步加深對(duì)G-CSF誘導(dǎo)免疫耐受機(jī)制的了解、為對(duì)其進(jìn)行調(diào)控打下基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.收集標(biāo)本：分別留取23位骨髓移植供者應(yīng)用G-CSF動(dòng)員前及應(yīng)用G-CSF動(dòng)員3天后的外周血標(biāo)本10ml，使用肝素抗凝。
　　 2.分組：共分為兩組，即供者應(yīng)用G-CSF動(dòng)員前的外周血標(biāo)本和供者應(yīng)用G-CSF動(dòng)員后的外周血標(biāo)本，為配對(duì)標(biāo)本。
　　 3.應(yīng)用免疫磁珠分

5、選法分選CD4+T細(xì)胞：從采集的外周血標(biāo)本分離出單個(gè)核細(xì)胞后，再應(yīng)用免疫磁珠分選的方法分離CD4+T細(xì)胞并提純，最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+T細(xì)胞的純度并計(jì)數(shù)。
　　 4.流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)G-CSF動(dòng)員前及G-CSF動(dòng)員后的CD4+T細(xì)胞中Th1、Th2的數(shù)量及Th1/Th2比值。
　　 5.制備cDNA：把分選得來(lái)的CD4+T細(xì)胞應(yīng)用Trizol試劑盒提取RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。
　　 6.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量

6、聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time Ouantitative PCR，RQ-PCR）方法分別檢測(cè)體內(nèi)應(yīng)用G-CSF動(dòng)員前后G-CSFR、T-bet、GATA-3和STAT1表達(dá)量的變化。
　　 7.將純化的CD4+T細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，并在培養(yǎng)過(guò)程中加入不同濃度的G-CSF刺激，觀察其刺激T細(xì)胞增殖的作用。
　　 8.分別將應(yīng)用G-CSF刺激前后培養(yǎng)的CD4+T細(xì)胞收集，提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA.
　　 9.RQ

7、-PCR方法檢測(cè)體外培養(yǎng)的CD4+T細(xì)胞經(jīng)G-CSF刺激前后的G-CSFR、T-bet、GATAT-3和STAT1表達(dá)量變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.在流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+T細(xì)胞Th1/Th2比值結(jié)果顯示G-動(dòng)員后的Th1/Th2比值較動(dòng)員前的Th1/Th2比值有顯著的降低。
　　 2.我們對(duì)標(biāo)本進(jìn)行CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)，顯示G-CSF動(dòng)員3天后CD4+T細(xì)胞的數(shù)量和占單個(gè)核細(xì)胞的比例均增加。
　　 3

8、.應(yīng)用RQ-PCR檢測(cè)體內(nèi)應(yīng)用G-CSF動(dòng)員后G-CSFR、T-bet、GATA-3及STAT1表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示：雖這些基因的表達(dá)均有變化，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4.體外培養(yǎng)分離純化的CD4+T淋巴細(xì)胞，結(jié)果顯示：G-CSF可以刺激分離后的CD4+T淋巴細(xì)胞增殖，這種作用達(dá)峰時(shí)間為12-24小時(shí)，48小時(shí)后開(kāi)始下降，72小時(shí)后作用消失。G-CSF的刺激濃度以200ng/ml為宜，增加濃度，增殖指數(shù)未見(jiàn)

9、明顯的增加。
　　 5.RQ-PCR檢測(cè)在體外培養(yǎng)時(shí)加入G-CSF刺激前后的CD4+T細(xì)胞的G-CSFR、T-bet、GATA-3、STAT1的表達(dá)變化。結(jié)果顯示：在體外加入G-CSF刺激后，CD4+T細(xì)胞出現(xiàn)了G-CSFR和GATA-3表達(dá)的升高，T-bet和STAT1則出現(xiàn)下降。
　　 結(jié)論：
　　 1.體內(nèi)應(yīng)用G-CSF動(dòng)員后，Th1/Th2比值比動(dòng)員前顯著降低（P<0.01）。表明在供者體內(nèi)T淋巴細(xì)胞受到

10、G-CSF刺激后，
　　 CD4+T淋巴細(xì)胞會(huì)向Th2方向分化，這可能誘導(dǎo)了免疫耐受的產(chǎn)生。
　　 2.體內(nèi)應(yīng)用G-CSF動(dòng)員后，CD4+T細(xì)胞短期內(nèi)（至少3天內(nèi)）可以因G-CSF的刺激作用而出現(xiàn)增殖。
　　 3.體外培養(yǎng)分離純化的CD4+T淋巴細(xì)胞時(shí)加入G-CSF可以刺激分離后的CD4+T淋巴細(xì)胞增殖。這種作用12-24小時(shí)達(dá)到高峰，48小時(shí)后開(kāi)始下降，72小時(shí)后消失。G-CSF最適刺激濃度以200n/ml。<

11、br>　　 4.體內(nèi)應(yīng)用G-CSF動(dòng)員后G-CSFR的表達(dá)量未見(jiàn)增高，而在外培養(yǎng)CD4+T細(xì)胞并加入G-CSF刺激后會(huì)出現(xiàn)G-CSFR表達(dá)的增高，這可能與體內(nèi)、外環(huán)境的差異，以及體內(nèi)G-CSF濃度處于較低水平且濃度不穩(wěn)定有關(guān)。
　　 5.體內(nèi)應(yīng)用G-CSF動(dòng)員后GATA-3及T-bet的變化趨勢(shì)不明顯。而在體外培養(yǎng)應(yīng)用G-CSF后GATA-3出現(xiàn)明顯的升高同時(shí)T-bet則明顯降低，這可能與體內(nèi)外的環(huán)境差異有關(guān)。