利用G-CSF動員的PBMC制備的CMV-CTL治療異基因造血干細胞移植后HCMV感染的臨床研究.pdf

1、人巨細胞病毒（Human Cytomegalovirus，HCMV）為β-皰疹病毒的一種，為雙鏈DNA病毒，具有種屬特異性，其在我國人群的潛伏感染率達到90％。HCMV首先感染樹突狀細胞（dendritic cell，DC）等抗原提呈細胞（antigen presenting cell，APC），但感染后病毒并不能被徹底清除，病毒可潛伏在某些特定的CD34+造血祖細胞內，在其向髓系細胞的分化過程中，潛伏的病毒也被保存下來。當宿主免疫功能

2、低下時，潛伏的病毒可發(fā)生再次激活。
　　異基因造血干細胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）作為目前治療血液系統惡性腫瘤的方法已被廣泛應用，雖然造血干細胞移植的發(fā)展使血液系統惡性腫瘤的生存率有明顯提高。但移植后相關并發(fā)癥仍為影響患者預后的主要因素，由于移植過程應用致死劑量的放化療且移植后免疫抑制劑的應用而使患者免疫功能顯著降低，導致移植后感

3、染的發(fā)生率明顯增加，且移植早期發(fā)生感染會導致較高的致死率。而HCMV作為長期潛伏在人體內的機會致病菌，引起巨細胞病毒感染有很多移植相關危險因素。有研究分析得出清髓性預處理方案，巨細胞病毒感染前發(fā)生急性移植物抗宿主?。╝cute graft versus host disease，aGVHD）為移植后HCMV初次激活的危險因素，而原發(fā)病為淋巴瘤或多發(fā)性骨髓瘤患者則為移植后連續(xù)HCMV感染的危險因素。且有研究分析巨細胞病毒感染到巨細胞病毒感

4、染性疾病發(fā)生的危險因素，得出最初發(fā)生巨細胞病毒感染時CMV拷貝數高，且監(jiān)測到CMV拷貝數時粒細胞、淋巴細胞缺乏為巨細胞病毒感染發(fā)展為巨細胞病毒感染性疾病的危險因素，其中淋巴細胞缺乏可作為獨立因素預測巨細胞病毒感染發(fā)展為巨細胞病毒感染性疾病的風險[5]。
　　雖然更昔洛韋及膦甲酸鈉對控制CMV感染有一定療效，但抗病毒藥物存在明顯的骨髓抑制及腎臟損傷，可以延遲患者CMV特異性免疫的恢復，造成遲發(fā)型CMV感染的發(fā)生，且遲發(fā)型CMV感染的

5、病死率較高，可達40%以上。
　　隨著細胞治療的發(fā)展，抗病毒的細胞治療成為了研究的熱點，而細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）作為抗病毒細胞的主要效應細胞成為了研究的焦點。近幾年，各中心探索不同的細胞制備方法，并進行臨床試驗取得較好療效。目前制備巨細胞病毒特異性細胞毒性 T淋巴細胞的方法主要為體外培養(yǎng)，利用四聚體篩選，利用IFN-γ篩選等方法。體外培養(yǎng)法多采用樹突狀細胞為抗原呈遞細胞，利用巨細胞病

6、毒抗原負載樹突狀細胞后，利用成熟的樹突狀細胞去刺激淋巴細胞獲得病毒特異性 CTL。四聚體篩選技術，為利用 HLA-多肽四聚體及磁珠分選的方法可從供者體內分離針對CMV的特異 CTL。但四聚體篩選方法需提前明確患者的HLA的表達，并篩選不同HLA位點識別的肽段。利用γ-干擾素直接從供者外周血分離CTL的方法為采集CMV血清學陽性供者外周血分離單個核細胞，將單個核細胞與pp65抗原孵育，標記抗干擾素抗體，通過免疫磁珠分選陽性細胞，獲得CMV

7、特異性CTL。利用IFN-γ篩選雖然無HLA限制性，但需要大量供者外周血，且實驗成本較高。以上方法均應用供者外周血，有研究表明G-CSF動員后的外周血單個核細胞可抑制T淋巴細胞增值，并降低其IFN-γ及IL-4的釋放。但隨后有中心驗證可以利用G-CSF動員后的外周血制備CMV特異性CTL，且與傳統非動員PBMC進行比較，生物學特性無明顯差異[12]。
　　通過回顧性分析在本中心自2011年12月至2014年12月行異基因造血干細胞

8、移植患者398例，應用Kaplan Meier及Logistics回歸模型，分析了CMV感染的發(fā)生率及其發(fā)生的危險因素。經分析得出，398例患者中233例發(fā)生CMV感染，累計發(fā)生率為58.5%。單因素分析中，HLA不全相合、預處理過程中使用抗人免疫球蛋白（anti-human thymocyte globulig，ATG）、發(fā)生急性移植物抗宿主病(acute graft versus host disease，aGVHD)及激素用量≥1

9、mg/kg潑尼松與CMV感染發(fā)生率增加有關。多因素分析中，HLA不全相合（HR=2.765，p=0.000）、預處理過程中使用ATG（HR=3.866，p=0.000）及激素用量≥1mg/kg潑尼松（HR=4.767，p=0.000）使CMV感染的風險增加。綜上所述，供者與患者HLA不全相合、預處理過程中應用ATG及治療過程中激素用量≥1mg/kg潑尼松都會增加患者CMV感染的發(fā)生率。
　　利用G-CSF動員的外周血單個核細胞，通

10、過貼壁法分離樹突狀細胞及淋巴細胞，并利用覆蓋中國人群90%以上巨細胞病毒多肽去負載樹突狀細胞并激活淋巴細胞，制備CMV-CTL。通過分析細胞表型、細胞內IFN-γ檢測及細胞因子分泌的檢測來鑒定制備細胞的生物學特性。經分析得出，經培養(yǎng)淋巴細胞數量增多，CD3細胞比例明顯增高，經抗原刺激后制備細胞的細胞內IFN-γ分泌增高；細胞因子測定為IFN-γ、TNF-α及顆粒酶分泌相比陰性對照組明顯增高。綜上所述，經該體系制備的細胞毒性T淋巴細胞具有

11、特異性細胞殺傷活性。
　　自2015年4月至2016年3月，共6例患者在本中心入組臨床試驗，應用CMV特異性CTL治療造血干細胞移植后CMV感染。利用上述方法制備的CMV特異性CTL治療移植后CMV感染，輸注細胞數為1×107/m2/次，輸注周期為每周一次，直至CMV轉陰或連續(xù)輸注四次仍無效則停止輸注。CMV的監(jiān)測采用Q-PCR法，每周兩次。經分析得出，患者通過輸注CMV特異性CTL無不良反應發(fā)生，可以有效控制患者CMV感染。