供者來源的凋亡胸腺細(xì)胞誘導(dǎo)移植免疫耐受的機(jī)制.pdf

1、已證實(shí)凋亡細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)作用，凋亡小體可以調(diào)節(jié)同種異體器官移植免疫排斥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞首先被吞噬細(xì)胞（巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞為主）吞噬，然后通過釋放一些免疫抑制細(xì)胞因子（如TGF-β、IL-10、MIF等）或通過細(xì)胞-細(xì)胞接觸的方式直接誘導(dǎo)同種反應(yīng)性T細(xì)胞失活來減輕移植物的免疫排斥反應(yīng)，延長移植物存活。為明確在吞噬細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞以及吞噬后誘導(dǎo)免疫耐受中巨噬細(xì)胞和DC各自起多大作用，本實(shí)驗(yàn)通過檢測巨噬細(xì)胞和DC的吞噬能力，以及吞噬

2、凋亡細(xì)胞后各吞噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)能力以闡明凋亡細(xì)胞誘導(dǎo)移植免疫耐受的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。
　　 目的：探討供者來源的凋亡胸腺細(xì)胞輸注誘導(dǎo)移植免疫耐受機(jī)制，為臨床防治移植物排斥和自身免疫病提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：用地塞米松20μM誘導(dǎo)小鼠（BALB/c，H-2d）胸腺細(xì)胞凋亡；在560C水浴1小時(shí)獲得小鼠（BALB/c，H-2d）壞死胸腺細(xì)胞。分別將活的、壞死的、凋亡的BALB/c小鼠胸腺細(xì)胞2×107個(gè)/只，尾靜脈輸注到C57B

3、L/6小鼠體內(nèi)，7天后將BALB/c小鼠的皮膚移植給C57BL/6小鼠，觀察各組移植皮膚的存活時(shí)間。通過尾靜脈分別將經(jīng)熒光物質(zhì)PKH67或CFSE標(biāo)記后活的、壞死的、凋亡的BALB/c小鼠胸腺細(xì)胞輸注到C57BL/6小鼠體內(nèi)，在不同時(shí)間點(diǎn)處死小鼠，分離脾臟制備單個(gè)細(xì)胞，用熒光素標(biāo)記抗體（APC-CD11c，PE-B220，PE-F4/80）與脾細(xì)胞孵育，用流式細(xì)胞術(shù)分析C57BL/6小鼠脾臟內(nèi)pDC（CD11c+B220+）、DC（CD

4、11c+B220-）、巨噬細(xì)胞（F4/80+）對活的、壞死的、凋亡的胸腺細(xì)胞的吞噬能力；混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)觀察分別吞噬了同系或同種異基因凋亡胸腺細(xì)胞后C57BL/6小鼠的DC和巨噬細(xì)胞對BALB/c小鼠BMDC刺激C57BL/6小鼠T細(xì)胞增殖（CFSE標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)分析法）的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)。
　　 結(jié)果：⑴用Annexin-v/PI染色檢測，地塞米松誘導(dǎo)BALB/c小鼠胸腺細(xì)胞早期凋亡可達(dá)61.9%；用水浴加熱法誘導(dǎo)的壞死基本上

5、PI完全陽性。⑵分別輸注供者壞死的、活的或凋亡胸腺細(xì)胞對皮膚移植物存活時(shí)間的影響：凋亡細(xì)胞處理組平均存活時(shí)間是15.889±2.088天，活細(xì)胞處理組平均存活時(shí)間是9.000±1.323天，壞細(xì)胞處理組為7.333±1.323天，PBS對照組的平均存活時(shí)間是10.111±1.616天。凋亡細(xì)胞組皮膚生存時(shí)間比其它各組都長（n=9，p<0.01），壞細(xì)胞組皮膚生存時(shí)間短于PBS組（n=9，p<0.01）。⑶分析不同時(shí)間點(diǎn)C57BL/6小鼠

6、脾臟內(nèi)吞噬細(xì)胞對BALB/c小鼠的凋亡胸腺細(xì)胞的吞噬情況：結(jié)果表明在輸注凋亡胸腺細(xì)胞后60min時(shí)，DC和巨噬細(xì)胞的吞噬效率都是最高，而且在觀察所有時(shí)間點(diǎn)CD11clow B220-DC（imDC）細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的吞噬效率要明顯高于CD11chigh B220－DC(mDC)細(xì)胞和CD11c+B220+DC（pDC）的細(xì)胞；F4/80low Mφ對凋亡細(xì)胞的吞噬效率要比F4/80high Mφ高。凋亡細(xì)胞輸注24小時(shí)后脾臟內(nèi)檢測不出凋亡

7、細(xì)胞存在。C57BL/6小鼠脾臟內(nèi)吞噬細(xì)胞對活的、壞死的和凋亡的BALB/c小鼠的胸腺細(xì)胞的吞噬差異情況：在活胸腺細(xì)胞尾靜脈輸注時(shí)，脾臟內(nèi)吞噬細(xì)胞的吞噬率都低于凋亡細(xì)胞組，可能由于活細(xì)胞在體內(nèi)是不會(huì)被吞噬的，只有少量在輸注前就已經(jīng)存在的自然凋亡細(xì)胞被吞噬細(xì)胞所吞噬；DC對凋亡胸腺細(xì)胞的吞噬效率也高于壞死胸腺細(xì)胞；F4/80low Mφ對凋亡細(xì)胞的吞噬率為21.3%，對壞死細(xì)胞的吞噬率為1.1%，F(xiàn)4/80high Mφ對凋亡細(xì)胞的吞噬率

8、為9.5%，對壞死細(xì)胞的吞噬率為12.1%，表現(xiàn)出相反的結(jié)果。⑷DC和巨噬細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞后，免疫調(diào)節(jié)能力的差異：通過混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)吞噬了凋亡細(xì)胞的巨噬細(xì)胞和DC都能明顯抑制同種細(xì)胞刺激的T細(xì)胞增殖反應(yīng)，且比沒加入調(diào)節(jié)細(xì)胞組和沒有吞噬凋亡的巨噬細(xì)胞和DC組的抑制能力強(qiáng)；吞噬細(xì)胞吞噬了同種異基因凋亡胸腺細(xì)胞對增殖的抑制能力比其吞噬同系凋亡細(xì)胞后的抑制能力強(qiáng)，說明凋亡細(xì)胞在體內(nèi)吞噬所產(chǎn)生的免疫抑制效應(yīng)是有抗原特異性的。
　

9、　 結(jié)論：①供著來源的凋亡胸腺細(xì)胞可以明顯延長皮膚移植物存活時(shí)間，而活細(xì)胞和壞死胸腺細(xì)胞的過繼輸注卻沒有這樣的效果。②活細(xì)胞在體內(nèi)是不能被吞噬的，而壞死細(xì)胞的吞噬卻能誘發(fā)炎癥反應(yīng)，加速皮膚移植物的排斥。在對脾臟內(nèi)具體細(xì)胞的吞噬能力的研究發(fā)現(xiàn)，DC中的CD11clow B220+（imDC）的吞噬能力是所有DC亞類中最強(qiáng)的，F(xiàn)4/80low的巨噬細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的吞噬效率高于F4/80high的巨噬細(xì)胞，而對壞死細(xì)胞的吞噬效率兩者卻相反。