供者凋亡細(xì)胞誘導(dǎo)恒河猴同種異體腎移植免疫耐受的初步研究.pdf

1、目的: 研究恒河猴類人血型的檢測方法；建立恒河猴同種異體腎移植模型：研究誘導(dǎo)恒河猴外周血單個(gè)核細(xì)胞凋亡的方法；研究供者凋亡細(xì)胞對恒河猴同種異體腎移植免疫耐受的誘導(dǎo)。 方法: 1、43只恒河猴，肌注氯胺酮麻醉后，分別抽取靜脈血5ml，肝素抗凝。分別收集恒河猴唾液。應(yīng)用常規(guī)單克隆抗體法、凝集抑制實(shí)驗(yàn)法(檢測唾液)、抗A抗B凝集素檢測法(反向定型法)共三種方法測定恒河猴的類人血型。 2、建立恒河猴同種異體腎移植

2、模型：4只恒河猴隨機(jī)配成兩對，每只恒河猴均捐出左腎，保留右腎，同時(shí)接受另一只恒河猴的左腎移植。供腎切?。貉刂芯€切開腹部，顯露左腎。上血管夾前給予肝素(100u/kg，iv)。切下腎臟后用4℃HCA保存液50ml灌注。受者手術(shù)：沿中線切開腹部，游離腹主動(dòng)脈和下腔靜脈遠(yuǎn)端，上血管夾前靜脈注射肝素(100u/kg，iv)。腎動(dòng)脈、靜脈分別于腹主動(dòng)脈、下腔靜脈遠(yuǎn)端行端側(cè)吻合。血管吻合過程中應(yīng)用顯微外科器械、7/0無損傷血管縫合線。輸尿管與膀胱吻

3、合，并臨時(shí)留置雙豬尾支架管。術(shù)后給予阿司匹林100mg口服，共3天。術(shù)后采用亞臨床劑量免疫抑制方案：甲基強(qiáng)的松龍+環(huán)磷酰胺+雷帕霉素。術(shù)中、術(shù)后一天、二天靜脈注射甲基強(qiáng)的松龍均為120mg；環(huán)磷酰胺20mg，術(shù)前4天開始，每兩同一次；雷帕霉素0.4mg，手術(shù)R開始，每日一次。術(shù)后抗生素：硫酸慶大霉素(10000u/kg/d，IM)。 3、在我們的研究中有一個(gè)重要的問題值得注意，即細(xì)胞凋亡后很容易發(fā)生繼發(fā)性壞死，而壞死細(xì)胞對免疫的

4、影響與凋亡細(xì)胞截然不同，因此在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的同時(shí)應(yīng)盡量減少壞死細(xì)胞。為此我們比較了高能X線法、(Co60 γ射線法、紫外線(UVC)照射法三種方法，發(fā)現(xiàn)紫外線(UVC)照射法效果最佳，因此我們對紫外線照射法進(jìn)行了詳細(xì)的研究，在不同的照射時(shí)間(40，50，60分鐘)、照射距離(15，20，30厘米)、不同的小牛血清濃度(10％，15％，20％)、不同的液面高度(0.106，0.142，0.177厘米)等條件下的凋亡率，確定誘導(dǎo)恒河猴外周血

5、單個(gè)核細(xì)胞凋亡的最佳條件。 4、供者凋亡的單個(gè)核細(xì)胞預(yù)輸注誘導(dǎo)恒河猴同種異體腎移植免疫耐受：6只恒河猴隨機(jī)配對分為兩組，即凋亡組和對照組。凋亡組接受對照組配對供者的凋亡細(xì)胞。制備的凋亡細(xì)胞用20m1PBS液稀釋后輸注給凋亡組配對的受者。對照組輸注PBS液20ml作為空白對照處理。每只恒河猴均接受對方左側(cè)供腎，行腎移植術(shù)，保留右側(cè)腎臟。 (1)大量凋亡的單個(gè)核細(xì)胞制備抽取供者恒河猴外周血50ml，應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液分離

6、單個(gè)核細(xì)胞，應(yīng)用UVC法照射單個(gè)核細(xì)胞，誘導(dǎo)單個(gè)核細(xì)胞凋亡條件：培養(yǎng)皿直徑為6cm，lo％小牛血清培養(yǎng)基4ml，照射距離20cm，照射時(shí)間為60分鐘。制備凋亡細(xì)胞后應(yīng)用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測凋亡率，同時(shí)靜脈輸注給受者猴，7天后行同種異體腎移植術(shù)。 (2)術(shù)后免疫抑制劑的方案同前。 (3)術(shù)后動(dòng)態(tài)監(jiān)測血常規(guī)、雷帕霉素濃度、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；定期行移植腎B超、CT檢查和移植腎穿刺病理檢查，觀察移植腎存活時(shí)間

7、。 結(jié)果： 1、應(yīng)用常規(guī)單克隆抗體法檢測恒河猴類人血型沒有一例出現(xiàn)陽性凝集反應(yīng)，不能檢測出恒河猴類人血型。凝集抑制實(shí)驗(yàn)(檢測唾液)檢測恒河猴唾液類人血型也未出現(xiàn)陽性反應(yīng)。所以，單克隆抗體法、凝集抑制實(shí)驗(yàn)法均不能檢測出恒河猴類人血型?？笰抗B凝集素檢測法(反向定型法)能測出每只恒河猴的類人血型。43只恒河猴中類人A型3只(7％)，類人B型25只(58.14％)，類人AB型15只(34.88％)。而未發(fā)現(xiàn)類人O型。

8、2、四只恒河猴左腎的切取和腎移植手術(shù)時(shí)間平均在兩小時(shí)內(nèi)完成，腎移植手術(shù)均成功，開放血流后移植腎即恢復(fù)功能，開始泌尿，術(shù)中尿量多，說明移植腎進(jìn)入多尿期。術(shù)后二天移植腎彩超檢查示移植腎血供良好。移植腎存活的時(shí)間分別為5，5，6，7天。移植腎均出現(xiàn)強(qiáng)烈的急性排斥反應(yīng)。術(shù)后未出現(xiàn)血腫、感染、尿瘺、輸尿血管梗阻等并發(fā)癥。其中一只恒河猴移植腎出現(xiàn)腎動(dòng)脈栓塞，移植腎存活5天；存活7天的恒河猴因腸梗阻而死亡。其余的猴切除排斥’腎臟后均存活。與正常腎比較

9、，術(shù)后移植腎明顯腫大，穿刺病理和移植腎切除病理示移植腎有許多炎性細(xì)胞浸潤，局灶性壞死。 3、由于在前期研究中發(fā)現(xiàn)紫外線(UVC)照射法明顯優(yōu)于高能X線法和Co60γ射線法，因此我們對紫外線誘導(dǎo)方法進(jìn)行了深入探討。發(fā)現(xiàn)影響細(xì)胞凋亡的主要因素有：照射距離、照射時(shí)間、培養(yǎng)液的量、小牛血清濃度。對UVC照射法重復(fù)研究，發(fā)現(xiàn)照射距離20厘米的凋亡率顯著高于照射距離30厘米的凋亡率(P<0.0001)、照射60分鐘的凋亡率顯著高于40、50

10、分鐘的凋亡率(P<0.01)，而其壞死率不超過10％、直徑6cm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液4ml時(shí)的凋亡率顯著高于培養(yǎng)液5m1時(shí)的凋亡率(P<0.01)，而其壞死率顯著低于培養(yǎng)液3ml時(shí)的壞死率(P<0.05)、用10％的小牛血清培養(yǎng)液時(shí)的凋亡率顯著高于用15％、20％的小牛血清培養(yǎng)液時(shí)的凋亡率(P<0.005)。 4、供者凋亡細(xì)胞預(yù)輸注后恒河猴同種異體腎移植結(jié)果： (1)、恒河猴外周血50ml，可分離出單個(gè)核細(xì)胞數(shù)為8×10

11、<'7>-8.5×10<'7>個(gè)，經(jīng)UvC照射后獲取的細(xì)胞總數(shù)(即為靜脈輸注的細(xì)胞總數(shù))為7.2×10<'7>-7.5×10<'7>個(gè)。其凋亡率為40-60％，壞死率為5-10％。 (2)、移植腎存活時(shí)間：凋亡組為7(手術(shù)原因死亡)，19，30天，對照組為5(移植腎動(dòng)靜脈血管栓塞)，6，14天。 (3)、凋亡組：99523術(shù)后6天B超示移植腎血流不豐富，移植腎輕度腫大，大小53×25×35mm，活檢病理示急性排斥

12、。術(shù)后7天死亡，死亡原因?yàn)槟c梗阻，其誘因是手術(shù)中結(jié)扎了腸系膜下動(dòng)脈。97387和00209術(shù)后7天B超示移植腎血流豐富，移植腎大小和結(jié)構(gòu)正常，大小分別為41×28×32mm、52×24×38mm，活檢病理見少量淋巴細(xì)胞浸潤。對照組：99581術(shù)后5天行移植腎B超檢查，發(fā)現(xiàn)移植腎明顯腫大，大小約55×25×40mm?；顧z病理檢查顯示移植腎大量淋巴細(xì)胞浸潤，廣泛局灶性的壞死。98447術(shù)后5天行B超檢查示移植腎大小為：43×18.3×37m

13、m，無血供；即行移植腎CT檢查，靜注造影劑后，移植腎不顯影，說明移植腎無血供。手術(shù)探查切除移植腎，術(shù)中見移植腎呈紫黑色，腎動(dòng)脈無搏動(dòng)。腎動(dòng)脈有血栓形成。切除移植腎送病理檢查顯示移植腎壞死。00473術(shù)后7天行B超檢查示移植腎結(jié)構(gòu)正常，大小為53×41×39mm，移植腎血流豐富，穿刺活檢病理見少量淋巴細(xì)胞浸潤。術(shù)后14天復(fù)查移植腎B超示血流豐富，阻力指數(shù)0.74。活檢病理見大量淋巴細(xì)胞浸潤。 (4)、CD4+CD25+淋巴細(xì)胞

14、亞群的監(jiān)測：凋亡組受者97387、00209的CD4+CD25+的百分率在術(shù)前為3.49％和3.19％；術(shù)后一周達(dá)到高峰，分別為11.79％和13.58％，約是術(shù)前的3-4倍。對照組00473的CD4+CD25+在術(shù)前、術(shù)后相對穩(wěn)定。 結(jié)論： 1、本研究對比了單克隆抗體法、凝集抑制實(shí)驗(yàn)法和抗A抗B凝集素檢測法(反向定型法)檢測恒河猴類人血型的情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示反向定型法測定恒河猴類人血型敏感，有效；恒河猴類人血型分布以B

15、型最多(58.14％)，AB型次之(34.88％)，A型最少(7％)；而無類人O型。而單克隆抗體法和凝集抑制實(shí)驗(yàn)法不能檢測恒河猴類人血型。 2、保留一側(cè)腎的恒河猴腎移植模型與以往模型相比有以下優(yōu)勢：(1)保留了受體的原腎，更見符合臨床情況，因?yàn)樵谂R床上對于受體原腎均不予切除，這樣不但可以減少創(chuàng)傷，而且更有利于術(shù)后恢復(fù)；(2)保留原腎更加有利于術(shù)后維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，減少圍手術(shù)期護(hù)理的難度；(3)移植物排斥時(shí)，將排斥的移植物切除后受

16、體猴可以長期存活，這不但更好地模擬了臨床情況，而且減少了受體猴不必要的死亡，更加符合動(dòng)物的倫理學(xué)；(4)由于受體猴能夠長期存活，更有利于我們長期對受體猴進(jìn)行免疫學(xué)的長期隨訪觀察，是我們進(jìn)行免疫耐受研究的良好模型。 3、誘導(dǎo)恒河猴外周血單個(gè)核細(xì)胞凋亡，紫外線照射法比高能X線和γ射線法敏感，效果好。紫外線照射誘導(dǎo)恒河猴外周血單個(gè)核細(xì)胞凋亡的最佳條件是用含lO％小牛血清的1640培養(yǎng)液，直徑6cm的培養(yǎng)皿中加培養(yǎng)液4ml，照射距離20