rFliC誘導(dǎo)同種移植免疫耐受的作用及機理研究.pdf

1、研究目的：
　　目前，同種器官移植已在臨床廣泛開展，對治療器官衰竭、血液疾病以及惡性腫瘤發(fā)揮了不可替代的作用。然而發(fā)生于移植術(shù)后數(shù)周或數(shù)月的急性排斥反應(yīng)(AR,Acute rejection)仍是導(dǎo)致治療失敗的主要因素。移植術(shù)后常規(guī)使用的免疫抑制性藥物嚴重降低了患者機體的免疫功能，導(dǎo)致了感染、肝腎損傷，影響了移植受者的預(yù)后。為解決這一難題，研究者們利用多種細胞和生物因子及制劑，通過不同途徑誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性的免疫耐受以克服非特異性

2、的免疫抑制劑的嚴重毒副作用。目前移植免疫耐受研究的熱點之一是擴增調(diào)節(jié)性T細胞(Regulatory T cell，Treg)或增強其功能。既往研究表明，Treg細胞是參與維持外周耐受的重要細胞，應(yīng)用Treg細胞誘導(dǎo)免疫耐受具有多種優(yōu)勢，因而有可能被發(fā)展為誘導(dǎo)移植免疫耐受和治療器官移植排斥的重要工具細胞。
　　目前體外擴增的Treg進行細胞治療方案的應(yīng)用受到很多因素制約，而應(yīng)用藥物擴增受體機體內(nèi)的Treg細胞比例或者增強Treg細胞

3、抑制能力的方案具有更好的應(yīng)用前景。人體內(nèi)的Treg細胞主要存在于CD4+CD25hi（高表達）細胞亞群中，約占外周血CD4+T細胞的1％～2％。Treg細胞作為在體內(nèi)外均具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)功能的重要細胞群，可根據(jù)其表達的細胞表面分子、產(chǎn)生的細胞因子及作用機制分為天然存在的CD4+CD25+Treg細胞(Naturally occurring CD4+CD25+Treg，nTreg)和誘導(dǎo)性CD4+CD25+Treg細胞(Induced C

4、D4+CD25+Treg，iTreg)。大量動物移植模型的研究證實，兩種Treg細胞對于維持移植物良好生存狀態(tài)都具有重要作用，提高Treg細胞比例可以誘導(dǎo)免疫耐受、減輕排斥反應(yīng)。在實體器官移植中，與等量nTreg相比，體內(nèi)和體外同種異體抗原特異性誘導(dǎo)產(chǎn)生的iTreg能更好地延長移植物存活期及誘導(dǎo)免疫耐受。
　　Treg細胞的免疫調(diào)節(jié)機制主要包括以下幾個方面:對抗原遞呈細胞(Antigen presenting cell，APC)的

5、抑制作用，介導(dǎo)靶細胞溶解、殺傷靶細胞，分泌TGF-β（Transformation growth factor-β，轉(zhuǎn)化生長因子-β）和IL-10（Interleukin-10，白介素-10）發(fā)揮免疫抑制功能等。Treg細胞抑制CD4+效應(yīng)T細胞的機制主要通過細胞間直接接觸、分泌細胞因子、與APC結(jié)合后改變其代謝途徑或分泌方式等途徑。Treg細胞除高表達CD4和CD25之外，還表達一種特征性標志Foxp3(Forkhead transc

6、ription factors，叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子3)，其對Treg細胞的表型、發(fā)育和功能性維持具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)機體內(nèi)Treg細胞比例和Foxp3的表達情況可以作為改善受體免疫狀態(tài)及誘導(dǎo)耐受的重要指標。然而關(guān)于如何擴增Treg細胞，上調(diào)Foxp3表達以及增強Treg細胞抑制性效應(yīng)的研究目前仍不夠明確，因此仍需尋找能夠有效擴增機體Treg細胞比例或增強其抑制能力的安全制劑。
　　研究發(fā)現(xiàn)，將人CD4+T細胞與基因重組鞭毛蛋白(rF

7、liC)體外共培養(yǎng)后可顯著增強CD4+CD25+Treg細胞的免疫抑制能力并提高Foxp3的表達。并且鞭毛蛋白可以保護機體免受化學(xué)、細菌、病毒以及放射性損傷。因此，鞭毛蛋白或可作為一種能夠增強Treg細胞功能，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生移植免疫耐受的制劑。鞭毛蛋白是細菌鞭毛的主要成分，是Toll樣受體5(Toll-like receptor 5，TLR5)的特異性配體。TLR5在人T細胞以及小鼠Treg細胞上均有表達。Toll樣受體(TLR)家族是介

8、導(dǎo)天然免疫的重要因素，可在病原體入侵機體的早期即啟動天然免疫，繼而激活獲得性免疫應(yīng)答，對免疫病理損傷有重要作用。鞭毛蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答依賴于經(jīng)典的TLR信號通路，可特異性激活TLR5，TLR5下游信號為MyD88依賴性并且與NF-κB或MAPK活化相關(guān)，MAPK通路受到多種因素的調(diào)控。
　　綜上所述，本論文的科學(xué)假設(shè)是:rFliC可通過擴增同種移植受體CD4+CD25+Treg細胞比例，提高Foxp3表達，增強其增殖能力及抑制性效

9、應(yīng)，誘導(dǎo)同種移植免疫耐受。本研究試圖闡明rFliC對同種移植物生存狀態(tài)的影響，并且探討rFliC此種作用的內(nèi)在機制、信號途徑及調(diào)控因素，從而為研究利用rFliC誘導(dǎo)移植免疫耐受提供理論和實驗依據(jù)，為臨床器官移植排斥的治療提供新的制劑，因此具有重要的理論和實際意義。
　　第一部分rFliC對小鼠同種皮膚移植物的影響及與TLR5表達的相關(guān)性
　　研究方法：
　　1、提取并純化基因重組鞭毛蛋白(rFliC)
　　利用攜

10、帶GST-FliC-Burkholderia pseudomallei基因的pGEX4T-2質(zhì)粒及BL21E.coli感受態(tài)菌構(gòu)建BL21 E.coli-GST-FliC菌株;抗生素抗性篩選后，對目標菌株進行活化及誘導(dǎo)表達，然后利用Glutathione Sepharose 4B凝膠提取基因重組鞭毛蛋白(rFliC)，并使用Toxin Eraser endotoxin removal resin去除細菌內(nèi)毒素(Lipid polysac

11、chride，LPS)污染。
　　2、構(gòu)建小鼠同種皮膚移植模型
　　無菌條件下將制備的C57BL/6小鼠背部全厚度皮片移植到BALB/c小鼠背部并進行包扎，移植術(shù)后第7日拆包。在移植術(shù)進行第-1、3、5、7、9、11日向?qū)嶒灲M小鼠i.p.注射rFliC(3mg/kg);同時設(shè)立等量PBS緩沖液注射組為對照組。
　　3、研究rFiiC對同種皮膚移植物生存狀態(tài)及生存期的影響
　　從拆包之日起，每日觀察兩組小鼠皮膚移植

12、物的生長狀態(tài)及排斥情況，記錄移植皮片排斥百分比及生存期。在PBS對照組小鼠的移植皮片完全排斥當日，脫頸椎處死兩組小鼠，完整取下供體皮片及受體移植床部位組織，進行甲醛固定并制備石蠟切片，應(yīng)用HE染色觀察移植物組織病理情況。
　　4、檢測rFliC對同種皮膚移植物與移植受體TLR5表達的影響
　　在PBS對照組小鼠的移植皮片完全排斥當日，取受體移植床部位的移植皮片組織，進行甲醛固定并制備石蠟切片，應(yīng)用抗-TLR5抗體進行免疫組化

13、染色觀察移植物TLR5表達情況。
　　研究結(jié)果：
　　1、PBS對照組小鼠的皮膚移植物較早出現(xiàn)硬化、結(jié)痂、皺縮，拆包后至完全排斥進程較快。與對照組相比，rFliC處理組小鼠的皮膚移植物生長狀況良好，排斥情況較輕，排斥進程較緩慢，皮膚移植物生存期明顯長于對照組(p＜0.05)。結(jié)果表示rFliC可以明顯延長小鼠同種皮膚移植存活期，改善移植物生存狀態(tài)。
　　2、移植物病理分析結(jié)果顯示:對照組小鼠移植皮片皺縮、變薄，表皮及真

14、皮明顯壞死，移植物與受體組織間連接疏松，受體組織內(nèi)存在大量以單個核細胞浸潤為主的細胞浸潤;而rFliC處理組小鼠的皮膚移植物平展、厚實，表皮及真皮未顯示明顯壞死，移植物與受體組織間連接緊密，受體組織內(nèi)的炎性細胞浸潤也較輕微。此結(jié)果進一步證實rFliC促進同種皮膚移植物生存。
　　3、移植物免疫組化染色結(jié)果顯示:與對照組相比，rFliC處理組小鼠皮膚移植物的TLR5被激活，呈高表達狀態(tài)，提示rFliC對同種皮膚移植物生存的影響可能與

15、TLR5激活相關(guān)。
　　第二部分rFliC對小鼠同種移植受體Treg細胞的影響
　　研究方法：
　　1、構(gòu)建小鼠同種皮膚移植模型
　　建立小鼠同種皮膚移植模型，隨機分為rFliC注射組、對照組及TLR5阻斷組。rFliC組:在移植術(shù)進行第-1、3、5、7、9、11日向小鼠i.p.注射rFliC(3mg/kg)，對照組小鼠i.p.注射PBS緩沖液;TLR5阻斷組:在移植術(shù)進行第-1日向小鼠注射rFliC前1h，向小

16、鼠i.p.注射TLR5抗體（200μg/只），其它處理同rFliC組。
　　2、檢測移植受體CD4+CD25+Foxp3+細胞亞群比例
　　PBS對照組小鼠移植皮片完全排斥當日，脫頸椎法處死三組小鼠，制備脾細胞懸液及腋窩淋巴結(jié)細胞懸液，然后應(yīng)用CD4、CD25、Foxp3單克隆抗體進行熒光染色，使用流式細胞儀檢測三組小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞在CD4+細胞中的比例。
　　3、檢測移植受體脾細胞Fox

17、p3表達狀況
　　在PBS對照組小鼠移植皮片完全排斥當日，脫頸椎處死三組小鼠，取出脾臟，進行甲醛固定并制備石蠟切片，應(yīng)用抗-Foxp3抗體進行免疫組化染色檢測受體小鼠脾Foxp3表達情況。
　　4、檢測移植受體Treg相關(guān)分子表達
　　PBS對照組小鼠移植皮片完全排斥當日，脫頸椎處死三組小鼠，取出脾臟，制備脾細胞懸液并應(yīng)用免疫磁珠分離CD4+CD25+Treg細胞。應(yīng)用實時定量RT-PCR技術(shù)檢測TLR5、Foxp3、

18、TGF-β1及IL-10表達水平。應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測TLR5及Foxp3表達。
　　5、移植受體Treg細胞增殖實驗
　　PBS對照組小鼠移植皮片完全排斥當日，脫頸椎處死三組小鼠，取出脾臟，制備脾細胞懸液，并進一步分離CD4+CD25+Treg細胞。將三組Treg細胞分別培養(yǎng)4d后，向培養(yǎng)基內(nèi)摻入3H-TdR，繼續(xù)孵育16h后，收集細胞，應(yīng)用液體閃爍計數(shù)器檢測各組細胞dpm(Decay per minute

19、)計數(shù)。
　　6、移植受體Treg細胞抑制實驗
　　PBS對照組小鼠移植皮片完全排斥當日，脫頸椎處死三組小鼠，取出脾臟，制備脾細胞懸液，并進一步分離CD4+CD25+Treg細胞及CD4+CD25-Teff細胞（Effector T cell，效應(yīng)T細胞），同時使用野生型BALB/c小鼠制備Teff細胞。分別將對照組、rFliC處理組及TLR5阻斷組小鼠Treg細胞培養(yǎng)3d，然后將對照組、rFliC處理組及野生型小鼠Teff

20、分別與三組Treg進行混合，繼續(xù)孵育24h后向培養(yǎng)基內(nèi)摻入3H-TdR，孵育16h后，收集細胞，應(yīng)用液體閃爍計數(shù)器檢測各組細胞dpm計數(shù)。
　　7、制備同種抗原
　　制備野生型B6小鼠脾細胞懸液后，加入40μg/ml絲裂霉素C避光孵育40min，PBS洗滌后，用培養(yǎng)液重懸，即為同種（異型）抗原遞呈細胞(APC)。
　　野生型B6小鼠的脾細胞進行超聲破碎后離心收集上清，即為可溶性同種（異型）抗原。
　　8、檢測體外

21、同種抗原刺激下Treg細胞相關(guān)分子表達
　　制備野生型BALB/c小鼠CD4+CD25+Treg細胞，加入同種抗原刺激后收集細胞，應(yīng)用半定量RT-PCR技術(shù)檢測TLR5、Foxp3、TGF-β1及IL-10表達情況，應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測TLR5及Foxp3表達情況。TLR5阻斷組:將Treg細胞用TLR5阻斷抗體進行預(yù)處理。
　　9、體外同種抗原刺激Treg細胞增殖實驗
　　制備野生型BALB/c小鼠C

22、D4+CD25+Treg細胞，分別加入APC細胞、APC+rFliC或rFliC進行刺激后，摻入3H-TdR檢測細胞增殖水平。TLR5阻斷組:將Treg細胞用抗TLR5阻斷抗體進行預(yù)處理。
　　10、體外同種抗原刺激Treg細胞抑制功能實驗
　　制備野生型BALB/c小鼠CD4+CD25+Treg細胞及CD4+CD25-Teff細胞，首先對Treg細胞進行APC或APC+rFliC刺激，然后洗滌，再將Treg與Teff共培養(yǎng)

23、，最后檢測共培養(yǎng)細胞增殖水平。TLR5阻斷組:將Treg細胞應(yīng)用阻斷抗體進行預(yù)處理。
　　研究結(jié)果：
　　1、rFliC處理組小鼠脾淋巴細胞及腋窩淋巴結(jié)細胞CD4+CD25+Foxp3+細胞亞群在CD4+T細胞中的比例均顯著高于對照組。TLR5阻斷組小鼠脾淋巴細胞及腋窩淋巴結(jié)細胞中三陽性Treg細胞比例均明顯低于rFliC處理組。結(jié)果表明rFliC可以擴增同種移植受體Treg細胞比例，此作用與TLR5途徑相關(guān)。
　　2

24、、三組小鼠脾免疫組化染色結(jié)果顯示:與PBS對照組相比，rFliC處理組小鼠Foxp3表達顯著增加，而TLR5阻斷組Foxp3表達與rFliC處理組相比受到明顯抑制。此結(jié)果表明，rFliC可通過TLR5相關(guān)性途徑激活小鼠同種移植受體Treg細胞，上調(diào)Foxp3表達。
　　3、應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)檢測移植受體Treg細胞TLR5、Foxp3、TGF-β1及IL-10的表達情況。結(jié)果顯示:rFliC處理組四種分子的mRNA表達與PBS

25、對照組相比均有顯著提高;而應(yīng)用TLR5阻斷抗體之后，rFliC對四種分子表達的上調(diào)作用受到顯著抑制。各組小鼠Treg細胞表達TLR5和Foxp3的情況通過Western blot技術(shù)進行了驗證。以上結(jié)果表明rFliC對同種移植小鼠模型的刺激可增加Treg相關(guān)分子的表達，而此種作用與TLR5途徑相關(guān)，結(jié)果進一步證實了rFliC對移植受體Treg細胞的激活作用。
　　4、移植受體Treg細胞增殖實驗結(jié)果顯示:rFliC處理組小鼠Tre

26、g細胞增殖水平與PBS對照組相比顯著增高，而TLR5阻斷組小鼠Treg細胞的增殖水平相比rFliC處理組受到明顯抑制。此結(jié)果表明rFliC通過TLR5依賴性途徑上調(diào)移植受體Treg細胞的增殖功能。
　　5、移植受體Treg細胞與Teff細胞共培養(yǎng)結(jié)果顯示，三組Treg細胞中rFliC-Treg對Teff的抑制能力最強，而此作用在TLR5阻斷后受到明顯下調(diào)。以上結(jié)果表明rFliC對移植受體Treg細胞的功能起到激活上調(diào)作用，此作用與

27、TLR5途徑相關(guān)。
　　6、rFliC對體外同種抗原刺激的Treg細胞的分子表達及功能的影響與體內(nèi)實驗結(jié)果一致，從體外進一步證實了rFliC對同種抗原刺激的Treg細胞的作用。
　　第三部分rFliC對同種抗原激活的Treg細胞Foxp3表達影響的分子機理與調(diào)控
　　研究方法：
　　1、檢測rFliC對Treg細胞JNK、p38MAPK信號的活化情況
　　應(yīng)用同種抗原刺激野生型BALB/c小鼠CD4+CD2

28、5+Treg細胞后，加入rFliC進行梯度時間刺激，用Western blot檢測各時間點JNK及p38MAPK磷酸化情況。
　　2、檢測rFliC活化的Treg細胞JNK、p38MAPK信號與Foxp3表達的相關(guān)性
　　應(yīng)用同種抗原刺激Treg細胞，阻斷JNK及p38MAPK信號，加入rFliC刺激后，Western blot檢測Foxp3蛋白表達情況。
　　3、檢測rFliC對Treg細胞PI3K-Akt信號的活化

29、情況
　　應(yīng)用同種抗原刺激Treg細胞后，加入rFliC進行梯度時間刺激，用Western blot檢測各時間點Akt磷酸化情況。
　　4、檢測Treg細胞中rFliC激活的PI3K信號對p38MAPK活化的影響
　　應(yīng)用同種抗原刺激Treg細胞，阻斷PI3K信號，加入rFliC刺激后，用Western blot檢測不同時間點p38MAPK磷酸化情況。
　　5、檢測Treg細胞中rFliC激活的PI3K信號與Fo

30、xp3表達的相關(guān)性
　　應(yīng)用同種抗原刺激Treg細胞，阻斷PI3K信號，加入rFliC刺激，應(yīng)用Western blot及RT-PCR檢測Foxp3表達情況;應(yīng)用同種抗原刺激小鼠脾淋巴細胞，阻斷PI3K信號，加入rFliC刺激，應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測CD4+CD25+Foxp3+細胞在CD4+T細胞中的比例。
　　6、檢測Treg細胞中rFliC激活的PI3K及p38MAPK信號與Foxp3表達的相關(guān)性
　　應(yīng)用同種抗原刺

31、激Treg細胞后，先阻斷p38信號，再阻斷PI3K信號，然后加入rFliC刺激，應(yīng)用Western blot及RT-PCR檢測Foxp3表達情況;應(yīng)用同種抗原刺激小鼠脾淋巴細胞后，先阻斷p38信號，再阻斷PI3K信號，加入rFliC刺激后應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測CD4+CD25+Foxp3+細胞在CD4+T細胞中的比例。
　　研究結(jié)果：
　　1、rFliC作用于同種抗原激活的Treg細胞，可活化JNK及p38MAPK信號。而p38

32、MAPK信號與rFliC引起的Foxp3表達上調(diào)相關(guān)，即rFliC對同種抗原激活Treg細胞Foxp3表達的作用通過rFliC-p38-Foxp3通路實現(xiàn)。
　　2、rFliC可以激活同種抗原刺激Treg細胞的PI3K-Akt信號。并且PI3K信號對p38MAPK活化具有負調(diào)節(jié)作用。
　　3、PI3K對rFliC-p38-Foxp3通路具有負調(diào)控作用，而調(diào)控方式通過抑制p38MAPK信號活化實現(xiàn)。
　　全文結(jié)論：

33、>　　1.rFliC體內(nèi)應(yīng)用可以明顯改善小鼠同種皮膚移植物生存狀態(tài)，延長移植物生存期，誘導(dǎo)同種移植免疫耐受。并且rFliC可激活移植物TLR5表達，提示rFliC誘導(dǎo)同種移植免疫耐受的作用與TLR5途徑相關(guān)。
　　2.rFliC可明顯提高同種移植受體CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例，上調(diào)Treg細胞相關(guān)分子Foxp3等表達水平，增強Treg細胞功能，并且這些作用都與TLR5途徑相關(guān)。提示rFliC誘導(dǎo)同種移植免疫耐受

34、的機制可能是通過TLR5相關(guān)途徑上調(diào)Treg細胞功能。
　　3.rFliC刺激Treg細胞后對Foxp3表達的上調(diào)可通過rFliC-p38MAPK-Foxp3通路實現(xiàn)，而PI3K可通過抑制p38信號活化對此通路起負調(diào)控作用。
　　論文創(chuàng)新點：
　　1.首次利用小鼠同種皮膚移植模型，證實rFliC可明顯延長小鼠同種皮膚移植物生存時間，誘導(dǎo)同種移植免疫耐受，從而為進一步研發(fā)誘導(dǎo)實體器官移植免疫耐受的新型制劑提供了實驗依據(jù)。

35、
　　2.首次證實rFliC可以提高小鼠同種移植受體CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例及功能，并且作用機制與TLR5途徑相關(guān)。為研究鞭毛蛋白誘導(dǎo)同種移植免疫耐受的細胞及分子機制提供了實驗基礎(chǔ)及理論依據(jù)。
　　3.首次證實rFliC上調(diào)Treg細胞Foxp3表達的作用與p38MAPK活化相關(guān)，即可通過rFliC-p38-Foxp3通路實現(xiàn)，證實了PI3K信號對此通路具有負調(diào)控作用。從而為研究鞭毛蛋白誘導(dǎo)同種移植免疫