CTLA4-Ig誘導(dǎo)大鼠供受體混合脾細(xì)胞的無反應(yīng)性及其介導(dǎo)同種異體腎移植免疫耐受的實驗觀察.pdf

1、背景和目的：腎移植是目前治療終末期腎臟疾病最有效的方法。成功的腎移植可使移植腎具有較高的長期存活率，術(shù)后患者的長期存活率和生活質(zhì)量也高于透析患者。目前，腎移植技術(shù)已日趨成熟，影響移植腎存活率的主要因素是腎移植后排斥反應(yīng)的發(fā)生。免疫抑制劑的問世雖然使腎移植取得了里程碑式的進(jìn)步，但每天給予非特異性免疫抑制劑易引發(fā)二重感染、腫瘤等嚴(yán)重的并發(fā)癥，絕大部分神經(jīng)鈣蛋白抑制劑尚有腎毒性作用。因此，誘導(dǎo)對移植物的免疫耐受是解決排斥的最理想方法，也是當(dāng)今

2、移植學(xué)界研究的熱點。 腎移植排斥反應(yīng)是由于T細(xì)胞的異?；罨細(xì)胞的活化取決于第一信號與第二信號（共刺激信號）的共同作用，第一信號是抗原提呈細(xì)胞（APC）提呈的抗原肽-MHC分子（MHC-Ag）復(fù)合物與T細(xì)胞表面的受體（TCR）結(jié)合；第二信號是T細(xì)胞表面的共刺激分子與APC表面的配體結(jié)合，包括B7-CD28/CTLA4、CD40-CD154等，其中最重要的是由抗原提呈細(xì)胞表面的B7分子與T細(xì)胞表面的CD28/CTLA4結(jié)合產(chǎn)生。

3、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA4）是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）上的一種跨膜糖蛋白。CTLA4可阻斷B7/CD28共刺激信號通路，使接受了第一信號的異體抗原反應(yīng)性細(xì)胞處于無反應(yīng)狀態(tài)，甚至于程序性死亡，使細(xì)胞增殖和分化成細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞的作用受抑制，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞成為對特異性抗原無反應(yīng)性的T細(xì)胞。CTLA4-Ig是將CTLA4的胞外區(qū)與人IgFc段的CH2、CH3及γ區(qū)的氨基酸相結(jié)合而形成的一種融合蛋白，它仍保持與B7結(jié)合的生物學(xué)特性

4、，卻又具有了能溶于水和易于純化的優(yōu)點。 目前，很多研究報道了無反應(yīng)性T細(xì)胞在體內(nèi)和體外具有特異性免疫抑制活性。在人類骨髓移植中，使用無反應(yīng)性T細(xì)胞能降低移植物抗宿主性。因此，人們推測，應(yīng)用體外產(chǎn)生的無反應(yīng)性T細(xì)胞也能誘導(dǎo)人類實體器官的同種異體移植物的長期存活。本實驗利用大鼠作為研究對象，應(yīng)用CTLA4-Ig阻斷B7/CD28共刺激通路制備無反應(yīng)性T細(xì)胞，將無反應(yīng)性T細(xì)胞通過尾靜脈注射轉(zhuǎn)移到腎移植受體，探討無反應(yīng)性T細(xì)胞對同種異體

5、移植腎能否誘導(dǎo)免疫耐受的產(chǎn)生及其機(jī)理。為臨床腎移植排斥反應(yīng)的治療尋找一種新的安全有效的方法。 方法： 1.大鼠脾細(xì)胞混懸液的制備。 2.混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)：體外加入CTLA4-Ig到以SD大鼠脾細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞和以Wistar大鼠脾細(xì)胞作為刺激細(xì)胞的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中培養(yǎng)，檢測所得混合供受脾細(xì)胞有無增殖，沒有發(fā)生增殖的為無應(yīng)性T細(xì)胞。進(jìn)一步檢測這些無反應(yīng)性T細(xì)胞在體外能否抑制同種異體活性T細(xì)胞反應(yīng)，并檢測無反應(yīng)性T

6、細(xì)胞的抑制作用能否被rIL-2逆轉(zhuǎn)。 3.構(gòu)建大鼠同種異體原位腎臟移植模型。 4.實驗分組與輸注細(xì)胞：將34只受體SD大鼠隨機(jī)分為A、B、C、D四組，A組為實驗組，B、C、D組為對照組。分組依據(jù)為受體輸注的細(xì)胞種類，A組：輸注（供體脾細(xì)胞+受體脾細(xì)胞+CTLA4-Ig）制備的4×107無反應(yīng)性T細(xì)胞（10只）；B組：輸注4×107供受體脾細(xì)胞（10只）；C組：輸注（第三方脾細(xì)胞+受體脾細(xì)胞+CTLA4-Ig）制備的4×1

7、07無反應(yīng)性T細(xì)胞（8只）；D組：輸注1mlPBS（6只）。 5.觀察大鼠移植腎的存活時間及其組織病理變化：記錄21只受體大鼠移植腎的存活時間；另13只腎移植術(shù)后第3、11、28、60天，每組每天取一只受體的移植腎制作光鏡切片，觀察組織病理變化，并做Banff系統(tǒng)綜合評分[60]。 結(jié)果： 1.在供受體脾細(xì)胞的初級MLR中，CTLA4-Ig抑制了T細(xì)胞的增殖，隨濃度增加抑制能力增強(qiáng)，增殖反應(yīng)在CTLA4-Ig10

8、μg/ml時被完全抑制。而PBS對照組的MLR發(fā)生了增殖。每個濃度的增殖值兩兩比較：p<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 2.無反應(yīng)性T細(xì)胞能抑制相同供受體脾細(xì)胞MLR的增殖，隨無反應(yīng)性T細(xì)胞/混合淋巴細(xì)胞的比率增高，其抑制作用增強(qiáng)。每個比率的增殖值兩兩比較：p<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 3.加入rIL-2到無反應(yīng)細(xì)胞和以供體脾細(xì)胞作為刺激細(xì)胞的次級MLR中，隨rIL-2加入量的增加，其逆轉(zhuǎn)作用增加。且高劑量的rIL-2

9、（100 U/ml），引起了無反應(yīng)狀態(tài)的完全逆轉(zhuǎn)。每個劑量的增殖值兩兩比較：p<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 4.大鼠移植腎的平均存活時間比較：A組大鼠移植腎的平均存活時間（MST）為（102.0±92.0）天，較B組（10.6±2.3）天、C組（18.6±2.3）天和D組（8.0±1.8）天均明顯延長。 5.移植腎的組織病理變化：（1）肉眼觀察：A組大鼠移植腎的大小基本正常，表面色鮮紅，均勻、明亮；其它三組移植腎均有明

10、顯的腫脹和出血，體積增大，質(zhì)堅而脆，表面呈深紫紅色，呈“大紅腎”。（2）光鏡檢查：A組大鼠移植腎間質(zhì)僅見少量淋巴細(xì)胞及單核樣細(xì)胞浸潤，腎細(xì)小動脈無浸潤，腎小球、腎小管基本正常。其它三組均出現(xiàn)急性細(xì)胞性或血管性排斥反應(yīng)。（3）Banff系統(tǒng)綜合評分：A組大鼠移植腎的總分值低于其它三組，組織學(xué)損傷較其它三組輕（p均<0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義）。 結(jié)論： 1.體外研究表明，CTLA4-Ig阻斷B7/CD28共刺激通路能誘導(dǎo)無反應(yīng)