供體凋亡淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)移植耐受的免疫學(xué)機(jī)制初探.pdf

1、免疫耐受是解決移植排斥反應(yīng)的根本方法之一。目前采用的耐受誘導(dǎo)方法多以中央和外周耐受理論為基礎(chǔ)形成，但由于各種原因尚未取得預(yù)想的結(jié)果。凋亡是生物體內(nèi)的基本生理現(xiàn)象之一，對(duì)于維持機(jī)體內(nèi)在平衡非常關(guān)鍵。研究已發(fā)現(xiàn)，凋亡是機(jī)體維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)定的重要作用機(jī)制，而且凋亡細(xì)胞對(duì)炎性反應(yīng)的抑制性調(diào)節(jié)作用是一種主動(dòng)的過(guò)程：凋亡細(xì)胞通過(guò)分泌趨化因子、變換細(xì)胞膜表面特征“eat-me”分子，誘導(dǎo)吞噬細(xì)胞對(duì)其進(jìn)行清除，同時(shí)在清除過(guò)程中通過(guò)巨噬細(xì)胞等分泌炎癥抑制

2、性因子，如TGFβ、IL-10、PGE2等造成一個(gè)特殊的免疫微環(huán)境。正常生理狀態(tài)下，此過(guò)程可以促使相關(guān)淋巴細(xì)胞對(duì)其特征性抗原識(shí)別激活后產(chǎn)生免疫耐受，而不是引起炎性免疫應(yīng)答。根據(jù)凋亡細(xì)胞能夠主動(dòng)引起免疫耐受這一現(xiàn)象，孫爾維等首次提出利用供體凋亡細(xì)胞輸注受體誘導(dǎo)供體特異性免疫耐受的理論設(shè)想。由此，本課題組前期研究開(kāi)展了供體凋亡脾淋巴細(xì)胞對(duì)大鼠心臟、肝臟移植模型誘導(dǎo)耐受的實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)一定數(shù)量的供體凋亡脾淋巴細(xì)胞預(yù)輸注可以誘導(dǎo)大鼠心、肝臟移植

3、模型產(chǎn)生特異性免疫耐受，延長(zhǎng)移植存活時(shí)間。該發(fā)現(xiàn)初步驗(yàn)證了孫爾維等的理論設(shè)想，但對(duì)于供體凋亡細(xì)胞輸注如何誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生非特異性免疫耐受，其內(nèi)在作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和機(jī)制是什么，都尚未可知。同時(shí)，類似的相關(guān)機(jī)制研究，國(guó)內(nèi)外都未有報(bào)道可以用來(lái)參照和解釋，而了解供體凋亡細(xì)胞誘導(dǎo)移植耐受的內(nèi)在機(jī)制對(duì)于深入掌握該理論的中心環(huán)節(jié)、進(jìn)一步完善該理論設(shè)想，進(jìn)而指導(dǎo)更有效地實(shí)現(xiàn)耐受誘導(dǎo)有重要意義，所以，本課題在前期模型實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)供體凋亡脾淋巴細(xì)胞預(yù)輸注如何

4、誘導(dǎo)移植耐受的內(nèi)在機(jī)制展開(kāi)探索性研究，研究?jī)?nèi)容可以總結(jié)為以下三個(gè)部分： 第一章供體凋亡脾淋巴細(xì)胞的體內(nèi)示蹤研究 目的 觀察供體凋亡脾淋巴細(xì)胞輸注受體內(nèi)后的轉(zhuǎn)歸，以初步確定其作用的關(guān)鍵部位。 方法 選擇C57BL(C57；H-2b)純系小鼠，6-8周雄性，作為供體；Balb/c(BALB；H-2d)純系小鼠，8周雄性，作為受體。按照每處理組每時(shí)間點(diǎn)3只小鼠，每樣本設(shè)立3次重復(fù)進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：

5、(1)以CFSE熒光劑對(duì)供體脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記； (2)地塞米松共培養(yǎng)法誘導(dǎo)供體脾淋巴細(xì)胞凋亡，AnnexinV免疫磁珠分選富集供體凋亡脾淋巴細(xì)胞。 將供體凋亡細(xì)胞經(jīng)尾靜脈輸入受體內(nèi)后，分別于不同時(shí)間點(diǎn)： (3)組織學(xué)觀察肝、脾、肺臟組織中熒光標(biāo)記供體凋亡脾淋巴細(xì)胞的分布； (4)流式細(xì)胞術(shù)分析肝、脾臟組織中熒光陽(yáng)性細(xì)胞的比例。 結(jié)果 (1)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CFSE標(biāo)記細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性細(xì)胞比例

6、均大于95％。 (2)流式細(xì)胞術(shù)分析，地塞米松誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞經(jīng)富集，其比例可達(dá)到70％以上。 (3)熒光顯微鏡觀察：CFSE標(biāo)記示蹤細(xì)胞進(jìn)入受者體內(nèi)后，在30min內(nèi)在肺組織內(nèi)有明顯的匯集，后迅速減少，60min時(shí)僅發(fā)現(xiàn)零星熒光細(xì)胞，3h、12h組織內(nèi)熒光細(xì)胞完全消失；肝臟內(nèi)熒光細(xì)胞的比例也在短時(shí)間內(nèi)上升明顯，30min到60min之間組織中始終有大量熒光細(xì)胞，到3h尚有若干熒光細(xì)胞存在，其后逐漸下降，12h組織內(nèi)熒光細(xì)

7、胞消失；在所觀察的時(shí)間內(nèi)，脾臟中熒光細(xì)胞分布比例始終相當(dāng)?shù)汀?(4)流式細(xì)胞術(shù)分析：供體凋亡細(xì)胞輸注30min后的肝臟組織中熒光細(xì)胞比例為(17.3±5.9)％，脾臟組織檢查結(jié)果為(0.1±0.2)％；輸注90min后，肝臟組織中熒光細(xì)胞比例為(34.3±9.5)％，脾臟組織檢查結(jié)果為(1.4±0.5)％；輸注12h后，肝臟組織中熒光細(xì)胞比例為(1.4±0.5)％，脾臟組織檢查結(jié)果為(1.3±0.2)％。 結(jié)論

8、(1)供者凋亡脾淋巴細(xì)胞經(jīng)外周靜脈輸注后主要聚集并駐留于肝臟。鑒于肝臟本身的特殊免疫功能，初步推測(cè)肝臟為輸注供者凋亡細(xì)胞發(fā)生作用的關(guān)鍵位點(diǎn)。 (2)本研究采用的凋亡細(xì)胞標(biāo)記體內(nèi)示蹤方法--CFSE標(biāo)記細(xì)胞后誘導(dǎo)凋亡，再經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)組織內(nèi)細(xì)胞分布，輔以組織學(xué)檢測(cè)，可以作為一種可靠、高效、經(jīng)濟(jì)的凋亡細(xì)胞體內(nèi)示蹤研究技術(shù)方法。 第二章肝臟抗原遞呈細(xì)胞對(duì)供體凋亡脾淋巴細(xì)胞的吞噬作用 目的 以肝臟抗原遞呈細(xì)胞為

9、主，觀察受體肝臟對(duì)供體凋亡細(xì)胞的吞噬作用。 方法 選擇C57BL(C57；H-2b)純系小鼠，8周雄性，作為供體；Balb/c(BALB；H-2d)純系小鼠，12周雄性，作為受體。按照每處理組每時(shí)間點(diǎn)3只小鼠，每樣本設(shè)立3次重復(fù)進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)： (1供體CFSE標(biāo)記凋亡脾淋巴細(xì)胞的制備同第一部分； (2)酶消化、密度梯度離心、貼壁培養(yǎng)法分離肝臟抗原遞呈細(xì)胞，加入10倍于接種細(xì)胞數(shù)量的供體凋亡細(xì)胞與受體肝臟抗

10、原遞呈細(xì)胞一起培養(yǎng)，瑞氏-吉木薩染色法、間接免疫熒光法觀察體外實(shí)驗(yàn)肝臟抗原遞呈細(xì)胞對(duì)供體凋亡脾淋巴細(xì)胞的吞噬情況； (3)將供體凋亡細(xì)胞輸注90min后，同體外實(shí)驗(yàn)方法分離肝臟抗原遞呈細(xì)胞，間接免疫熒光結(jié)合CFSE雙熒光法，流式細(xì)胞術(shù)分析體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中肝臟抗原遞呈細(xì)胞對(duì)供體凋亡脾淋巴細(xì)胞的吞噬作用。 結(jié)果 (1)體外實(shí)驗(yàn)觀察：在共同培養(yǎng)15min內(nèi)就已經(jīng)發(fā)生了明顯的供體凋亡細(xì)胞吞噬反應(yīng)。在其后的時(shí)間里，一直存在活躍的

11、吞噬反應(yīng)。Kupffer細(xì)胞(Kupffercell，KC)、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(Liversinusoidalendothelialcell，LSEC)、樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendriticcell，DC)等三種肝臟抗原遞呈細(xì)胞均可發(fā)生對(duì)供體凋亡脾淋巴細(xì)胞的吞噬作用。 (2)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察：LSEC發(fā)生吞噬作用的比例為(61.90±10.22)％；KC發(fā)生吞噬作用的比例為(81.33±5.62)％；DC發(fā)生吞噬作用的比例為(45.47±14

12、.69)％，吞噬抗原能力由大到小依次為：KC，LSEC，DC(P=0.00190)。 結(jié)論 (1)受體肝臟抗原遞呈細(xì)胞有充分的能力處理供體凋亡淋巴細(xì)胞。 (2)由于在肝臟非實(shí)質(zhì)性細(xì)胞中所占比例的大小分別為：LSEC(50-60)％，KC＜20％，DC微量＜1％，初步推測(cè)對(duì)供體脾淋巴凋亡細(xì)胞的吞噬作用中LSEC與KC占主要部分，DC的比例最小。 第三章供體凋亡脾淋巴細(xì)胞預(yù)輸注對(duì)受體肝臟內(nèi)細(xì)胞因子微環(huán)境的影響

13、 目的 已知肝臟微環(huán)境對(duì)肝臟特有耐受現(xiàn)象的產(chǎn)生有重要作用，凋亡細(xì)胞發(fā)生免疫調(diào)節(jié)作用時(shí)也會(huì)同時(shí)伴有細(xì)胞因子等微環(huán)境的變化，本部分對(duì)肝臟免疫微環(huán)境中一系列重要細(xì)胞因子的變化進(jìn)行觀察，以了解供體凋亡脾淋巴細(xì)胞輸注對(duì)肝臟內(nèi)部免疫微環(huán)境的影響。 方法 選擇C57BL(C57；H-2b)純系小鼠，8周雄性，作為供體；Balb/c(BALB；H-2d)純系小鼠，10周雄性，作為受體。分組設(shè)計(jì)如下： (1)放射線

14、照射法誘導(dǎo)凋亡，富集和檢測(cè)方法同第一、二部分； (2)預(yù)輸注方法同第一、二部分，預(yù)輸注處理分組：DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基處理組(Controltreatmentgroup，CG)，供體脾臟活細(xì)胞處理組(Livecelltreatmentgroup，LG)，供體脾臟凋亡細(xì)胞處理組(Apoptoticcelltreatmentgroup，AG)； (3)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)：輸注后0h、1h、3h、6h、12h，每處理組每時(shí)間點(diǎn)3只小鼠；

15、 (4)提取樣本組織蛋白，檢測(cè)樣本來(lái)源：肝臟組織、脾臟組織； (5)Luminex液相芯片法檢測(cè)細(xì)胞因子：IL-1β，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-10，IL-12，TNFα，IFNγ，GMCSF： (6)所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS10.0、MINITAB12.2以及GraphPadPRISM3.02等軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和作圖。 結(jié)果 (1)實(shí)驗(yàn)分組處理對(duì)細(xì)胞因子的影響： ①輸

16、注處理的不同對(duì)IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNFα、IFNγ、以及GMCSF濃度水平影響的差異有顯著性意義，對(duì)IL-1β、IL-5、IL-12則無(wú)。 ②輸注時(shí)間的不同對(duì)IL-4、TNFα、IFNγ濃度水平影響的差異有顯著性意義，對(duì)IL-1β、IL-2、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12以及GMCSF則無(wú)。 ③組織來(lái)源的不同除對(duì)GMCSF水平無(wú)顯著性影響，對(duì)其他因子濃度水平影響的差異均有顯著性意義。

17、 (2)供體凋亡細(xì)胞輸注對(duì)肝臟組織中細(xì)胞因子微環(huán)境的影響 (3)供體凋亡細(xì)胞輸注對(duì)脾臟組織中細(xì)胞因子微環(huán)境的影響 結(jié)論 供體凋亡細(xì)胞輸注在肝臟組織被吞噬處理后，對(duì)肝臟局部的細(xì)胞因子微環(huán)境產(chǎn)生了特殊的影響，包括IL-1β、IL-4、IL-10以及IFNγ的特異性分泌水平提高。在供體凋亡細(xì)胞輸注后，脾臟組織細(xì)胞因子分泌出現(xiàn)的特殊變化則包括IL-2和IFNγ分泌水平升高。該變化如何對(duì)耐受誘導(dǎo)產(chǎn)生影響，還需要進(jìn)一步