過繼轉(zhuǎn)輸不同來源父系淋巴細胞誘導妊娠丟失孕鼠T細胞免疫耐受機制的研究.pdf

1、目的：在正常妊娠過程中，胎兒作為半同種異體移植物而未被母體排斥，實際上反映了母體對胚胎的免疫耐受。其中，受孕后母體外周及母-胎界面免疫細胞功能變化是維持母胎免疫耐受平衡狀態(tài)的關鍵。目前國內(nèi)外研究多采用父方淋巴細胞免疫治療不明原因復發(fā)性流產(chǎn)(Unexplainedrecurrent spontaneous abortion，URSA)，但是尚存在細胞來源不穩(wěn)定、規(guī)范程度不高、個體之間差異較大、各實驗室療效不一等不足，且有關其免疫作用機制尚

2、存疑點和分歧。
　　 本研究通過分析母體T細胞功能變化與妊娠丟失之間的關系，探討過繼轉(zhuǎn)輸不同來源的父系外周淋巴細胞進行免疫干預后，對妊娠丟失孕鼠母胎免疫耐受的誘導作用，為進一步研究URSA的免疫學發(fā)病機制及下一步指導臨床合理規(guī)范化進行過繼免疫治療提供實驗基礎和理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.建立妊娠丟失實驗動物模型及實驗分組：將雌雄小鼠隨機分為5組后按2:1合籠交配；CBA/J(♀)×DBA/2(♂)為URS

3、A組，CBA/J(♀)×BALB/c(♂)為正常妊娠對照組。再將URSA組的3組CBA/J雌鼠于孕4天（著床期）分別給予尾靜脈注射父方（同籠DBA/2雄鼠）、非父方（非同籠DBA/2雄鼠）、無關個體(BALB/c雄鼠)外周單個核細胞，分別為治療Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組；第4組CBA/J雌鼠注射等量生理鹽水，作為未經(jīng)免疫干預的URSA組。
　　 2.胚胎發(fā)育情況觀察：于妊娠第14天分別處死各組CBA/J孕鼠，測量胎盤體積、計數(shù)吸收胚胎數(shù)和

4、存活胚胎數(shù)，計算胚胎吸收率及流產(chǎn)發(fā)生率。
　　 3.孕鼠外周T細胞免疫功能檢測：妊娠第14天分別處死各組CBA/J孕鼠，無菌解剖取脾，制備單個細胞懸液。采用噻唑藍(MTT)染色法檢測ConA誘導T細胞轉(zhuǎn)化的A492值；細胞經(jīng)破膜處理后直接熒光標記流式細胞計數(shù)(FCM)分別檢測Th1型細胞因子IL-2、IFN-γ以及Th2型細胞因子IL-4、IL-10的表達。
　　 4.孕鼠母胎界面免疫抑制狀況的分析：妊娠第14天分別處死

5、各組CBA/J孕鼠，無菌解剖取胎盤組織，制備石蠟包埋切片。HE染色后光鏡下分別以矩形走形計數(shù)200個免疫細胞，計數(shù)大顆粒淋巴細胞(LGL)，小淋巴細胞，巨噬細胞(Mφ)等，計算各類免疫細胞的百分率。免疫組化染色后進行圖像分析，以灰度值(GS)分析TGF-β1、IL-10、COX-2等免疫抑制分子的表達強度，GS值大小與陽性表達強度呈反比；光鏡下以矩形走形計數(shù)200個細胞，分別計算陽性細胞百分率。
　　 5.統(tǒng)計學處理：應用SPS

6、S13.0版本軟件對各組數(shù)據(jù)進行正態(tài)性、方差齊性檢驗后，以卡方檢驗比較各組之間胚胎吸收率及胎盤組織陽性細胞百分率之間的差異，單因素方差分析比較各組孕鼠脾細胞中Th1/Th2型細胞因子、胎盤組織免疫抑制分子的表達是否存在差異。
　　 結(jié)果：
　　 1.過繼轉(zhuǎn)輸不同來源父系淋巴細胞對妊娠丟失孕鼠胚胎發(fā)育的影響妊娠丟失孕鼠(URSA組)的胚胎吸收率為22.58％，而正常妊娠動物模型孕鼠(Control組)的胚胎吸收率為5.23

7、％，過繼轉(zhuǎn)輸父系淋巴細胞治療Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組胚胎吸收率分別為5.50％、5.17％、5.84％;與未經(jīng)治療的URSA組相比，治療Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組胚胎吸收率均顯著下降（均P＜0.05）；三組組間比較無明顯差異(P＞0.05)，且均下降至正常妊娠對照組水平(均P＞0.05)。
　　 URSA組的流產(chǎn)發(fā)生率為44％，而Control組的流產(chǎn)發(fā)生率為20％。過繼轉(zhuǎn)輸父系淋巴細胞治療Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組流產(chǎn)發(fā)生率分別為24％、16％、20％;與未經(jīng)治療的

8、URSA組相比，治療Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組流產(chǎn)發(fā)生率顯著下降(均P＜0.05)，三組組間比較無明顯差異（P＞0.05），且均下降至正常妊娠對照組水平(均P＞0.05)。
　　 2.過繼轉(zhuǎn)輸不同來源父系淋巴細胞對妊娠丟失孕鼠外周T細胞免疫功能的影響
　　 2.1 ConA誘導T淋巴細胞轉(zhuǎn)化功能檢測未經(jīng)ConA誘導轉(zhuǎn)化時，與未孕CBA/J雌鼠脾細胞培養(yǎng)72h后A492值(0.198±0.074)相比較，正常妊娠組（Control組）、

9、未經(jīng)誘導的URSA組及三組經(jīng)父系細胞免疫干預的治療組孕鼠脾細胞的A492值均顯著升高(均P＜0.05)。其中，正常妊娠組與未經(jīng)治療的URSA組之間無明顯差異（分別為0.798±0.114、0.812±0.138，P＞0.05)，治療Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組之間無明顯差異（分別為0.699±0.315、0.659±0.134、0.632±0.132，P＞0.05），但較正常妊娠、未經(jīng)治療組相比均顯著下調(diào)(均P＜0.05)。
　　 經(jīng)ConA誘

10、導轉(zhuǎn)化后，與未孕CBA/J雌鼠脾細胞轉(zhuǎn)化A492值（1.221±0.034）相比較，正常妊娠組（Control組）、未經(jīng)誘導的URSA組及三組經(jīng)父系細胞免疫干預的治療組孕鼠脾細胞轉(zhuǎn)化均顯著下降（均P＜0.05。其中與正常妊娠組（1.011±0.134）相比較，未經(jīng)治療的URSA組雖有所下降，但統(tǒng)計學差異不顯著（1.001±0.178，P＞0.05）；治療Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組之間無明顯差異(分別為0.829±0.211、0.859±0.195、0

11、.812±0.168，P＞0.05)，均較正常妊娠、未經(jīng)治療組相比均顯著下調(diào)(均P＜0.05)。
　　 2.2 外周淋巴細胞Th1/Th2細胞功能檢測
　　 2.2.1 Th1型細胞因子的表達與正常妊娠對照組脾細胞IL-2表達百分率（6.40％±0.92％）相比，URSA組表達百分率顯著增高(19.73％±2.05％，P＜0.01)；經(jīng)過繼轉(zhuǎn)輸干預后治療Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組表達的百分率顯著降低至正常妊娠對照組水平(分別為6.

12、39％±1.21％、6.68％±1.07％、6.42％±1.21％，均P＜0.01)。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組表達的百分率組間比較無明顯差異（P＞0.05）。
　　 與正常妊娠對照組脾細胞IFN-γ表達百分率(7.41％±0.73％)相比，URSA組表達的百分率顯著增高(11.48％±1.10％，P＜0.01)；經(jīng)過繼轉(zhuǎn)輸干預后治療Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組表達的百分率顯著降低(分別為7.91％±0.76％、7.78％±0.82％、7.43％±1

13、.11％，均P＜0.01)至正常妊娠對照組水平。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組表達的百分率組間比較無明顯差異(P＞0.05)。
　　 2.2.2 Th2型細胞因子的表達與正常妊娠對照組脾細胞IL-4表達百分率（8.16％±0.92％）相比，URSA組表達百分率顯著降低(5.85％±0.57％，P＜0.05);經(jīng)過繼轉(zhuǎn)輸干預后治療Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組表達的百分率顯著增高(分別為9.87％±1.04％、9.03％±0.91％、8.96％±1.11％，

14、均P＜0.05)至正常妊娠對照組水平。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組表達的百分率組間比較無明顯差異(P＞0.05）。
　　 與正常妊娠對照組脾細胞IL-10表達百分率（5.06％±0.78％）相比，URSA組表達百分率顯著降低（3.94％±0.52％，P＜0.05）；經(jīng)過繼轉(zhuǎn)輸干預后治療Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組表達的百分率顯著增高（分別為5.93％±0.56％、5.94％±0.85％、6.12±0.96％，均P＜0.05)至正常妊娠對照組水平。Ⅰ組、

15、Ⅱ組、Ⅲ組表達的百分率組間比較無明顯差異(P＞0.05）。
　　 3.過繼轉(zhuǎn)輸不同來源父系淋巴細胞對妊娠丟失孕鼠胎盤局部免疫抑制狀態(tài)的影響
　　 3.1 胎盤組織中免疫細胞數(shù)量分析各組胎盤絨毛中均散在可見巨噬細胞(Mφ)、大顆粒淋巴細胞（Largegranulan lymphocyte，LGL）、小淋巴細胞等免疫細胞。正常妊娠對照組各類細胞百分率分別為17.85％±6.23％、65.25％±6.68％、15.10％±4.

16、42％，URSA組分別為19.85％±18.86％、64.85％±4.28％、12.60％±4.32％，治療Ⅰ組分別為18.85％±4.25％、65.20％±6.48％、15.95％±6.48％，治療Ⅱ組分別為18.73％±5.03％、68.11％±5.32％、13.16％±4.65％，治療Ⅲ組分別為17.87％±4.32％、67.41％±4.57、14.72％±3.82％，各組之間均無明顯統(tǒng)計學意義(均P＞0.05)。各組總淋巴細胞百

17、分率分別為82.25％±6.28％、80.15％±5.63％、81.14％±4.27％、81.28％±5.01％、82.30％±4.63％，相互之間均無明顯差異(均P＞0.05)。
　　 3.2 母胎界面免疫抑制因子表達分析各組胎盤滋養(yǎng)細胞、血管內(nèi)皮細胞及免疫細胞胞漿中均可見散在或片狀的TGF-β1、IL-10、COX-2陽性表達。
　　 3.2.1 免疫抑制分子陽性細胞表達率分析與正常妊娠對照組胎盤組織中TGF-β1陽

18、性細胞表達率(72.35％±5.47％)相比，URSA組陽性細胞表達率顯著降低（50.45％±5.39％）；經(jīng)過繼轉(zhuǎn)輸干預后治療Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組表達的百分率均顯著增高(分別為63.73％±5.12％、70.27％±3.94％、73.34％±5.44％，均P＜0.05)至正常妊娠對照組水平。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組表達的百分率組間比較無明顯差異(P＞0.05)。
　　 與正常妊娠對照組胎盤組織中IL-10陽性細胞表達率(69.25％±6.

19、37％)相比，URSA組陽性細胞表達率顯著降低(48.75％±4.32％，P＜0.05)；經(jīng)過繼轉(zhuǎn)輸干預后治療Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組表達的百分率均顯著增高(分別為71.25％±5.17％、76.57％±2.98％、65.98％±5.45％，均P＜0.05)至正常妊娠對照組水平。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組表達的百分率組間比較無明顯差異(P＞0.05)。
　　 與正常妊娠對照組胎盤組織中COX-2陽性細胞表達率(81.05％±4.43％)相比，UR

20、SA組陽性細胞表達率顯著降低（52.24％±4.04％P＜0.05）：經(jīng)過繼轉(zhuǎn)輸干預后治療Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組表達的百分率均顯著增高(分別為71.08％±3.78％、69.87％±4.34％、70.69％±3.74％，均P＜0.05)至正常妊娠對照組水平。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組表達的百分率組間比較無明顯差異(P＞0.05）。
　　 3.2.2 免疫抑制分子陽性表達強度分析與正常妊娠對照組胎盤組織中TGF-β1表達強度(71.60±7.04

21、)相比較，URSA組表達強度顯著降低(95.84±5.65，P＜0.05)；經(jīng)過繼轉(zhuǎn)輸干預后治療Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組表達強度顯著增高(分別為74.36±5.74、75.20±8.76、72.60±7.2，均P＜0.05)至正常妊娠對照組水平。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組表達的百分率組間比較無明顯差異（P＞0.05）。
　　 與正常妊娠對照組胎盤組織中IL-10表達強度(92.50±6.47)相比，URSA組表達強度顯著降低(118.50±8.6

22、1，P＜0.05)；經(jīng)過繼轉(zhuǎn)輸干預后治療Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組表達強度顯著增高(分別為94.00±6.54、100.20±6.53、100.80±11.49，均P＜0.05)至正常妊娠對照組水平。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組表達的百分率組間比較無明顯差異（P＞0.05）。
　　 與正常妊娠對照組胎盤組織中COX-2表達強度(82.60±5.37％)相比，URSA組表達強度顯著降低(96.92±5.42，P＜0.05)；經(jīng)過繼轉(zhuǎn)輸干預后治療Ⅰ組、Ⅱ

23、組、Ⅲ組表達強度顯著增高(分別為84.24±5.08、82.70±8.1、81.40±6.8，均P＜0.05)至正常妊娠對照組水平。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組表達的百分率組間比較無明顯差異(P＞0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1.妊娠期T細胞免疫耐受的維持在正常妊娠過程中發(fā)揮了關鍵作用，耐受缺失或不足是妊娠丟失的重要機制之一。
　　 2.TGF-β1、IL-10、COX-2等免疫抑制分子在胎盤組織中的低水平表達可能與復發(fā)