重組腺病毒AdCD40Ig聯(lián)合供體靜息B淋巴細(xì)胞預(yù)處理誘導(dǎo)小鼠皮膚移植耐受的研究.pdf

1、目的:研究重組腺病毒AdCD40Ig聯(lián)合供體靜息B淋巴細(xì)胞預(yù)處理策略在小鼠誘導(dǎo)建立特異性移植耐受,延長(zhǎng)后續(xù)進(jìn)入的供體來(lái)源皮膚移植物存活時(shí)間的作用.方法:自BALB/c小鼠脾臟提取總RNA,以兩對(duì)引物分別RT-PCR克隆小鼠CD40胞外區(qū)基因片段和小鼠IgG2a Fc段基因片段,并通過(guò)兩對(duì)引物之間特殊設(shè)計(jì)的17bp重疊區(qū)域,以重疊延伸法PCR擴(kuò)增出CD40Ig融合基因,后者克隆入pMD18-T進(jìn)行測(cè)序.將測(cè)序證實(shí)的CD40Ig基因克隆入腺

2、病毒載體AdEasy系統(tǒng)的穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV,再與其骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在大腸桿菌BJ51 83中同源重組,經(jīng)過(guò)293細(xì)胞包裝生成攜帶小鼠CD40Ig基因的重組腺病毒載體AdCD40Ig.PCR鑒定重組病毒,熒光計(jì)數(shù)測(cè)定重組病毒滴度,SDS-PAGE電泳和ELISA法檢測(cè)鑒定培養(yǎng)細(xì)胞的上清中CD40Ig蛋白表達(dá).建立小鼠皮膚移植模型,設(shè)定空白對(duì)照(1組)和第三方空白對(duì)照(2組),以AdCD40Ig(3組)、C57BL

3、/6靜息B細(xì)胞(4組)、AdCD40Ig聯(lián)合供體靜息B細(xì)胞(5組)及第三方實(shí)驗(yàn)對(duì)照(6組)等不同組合在皮膚移植前1周預(yù)先處理受體BALB/c小鼠,觀察皮膚移植物存活情況.雙抗夾心法ELISA測(cè)定AdCD40Ig處理后小鼠血清CD40Ig水平.結(jié)論:1.成功構(gòu)建攜帶小鼠CD40Ig基因的重組腺病毒AdCD40Ig,病毒滴度可達(dá)5×10<'9> efu/ml,體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)該載體能夠穩(wěn)定有效地表達(dá)CD40Ig融合分子.2.以AdCD40