重組腺病毒AdCTLA4-FasL聯(lián)合供者骨髓細(xì)胞輸注方案誘導(dǎo)異基因混合嵌合耐受的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[目的]異基因混合嵌合體能誘導(dǎo)受者對(duì)供者移植器官特異耐受，從而能夠避免器官移植后長(zhǎng)期運(yùn)用免疫抑制藥物。但是，迄今為止還沒(méi)有一種安全高效的異基因混合嵌合體誘導(dǎo)方案可供臨床運(yùn)用。在不對(duì)受體清髓處理的情況下，本研究探討運(yùn)用重組腺病毒AdCTLA4-FasL聯(lián)合供者骨髓移植方案能否誘導(dǎo)混合嵌合體和同種皮膚移植耐受，同時(shí)探討免疫抑制藥物對(duì)該方案誘導(dǎo)的混合嵌合耐受的影響。 [方法]1.運(yùn)用Adeasy系統(tǒng)重組腺病毒AdCTLA4-FasL，

2、酶切、PCR、WesternBlot鑒定。2.將BALB/c(H-2d)小鼠皮膚移植于C57BL/6(H-2b，B6)小鼠，同時(shí)經(jīng)尾靜脈注射BALB/c小鼠骨髓細(xì)胞和腺病毒AdCTLA4-FasL；運(yùn)用ELISA檢測(cè)CTLA4-FasL融合蛋白在血漿中的表達(dá)，組織學(xué)分析了解該融合蛋白的肝細(xì)胞毒性，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗H-2d單抗對(duì)受體小鼠外周血白細(xì)胞標(biāo)記后進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)異基因嵌合水平，觀(guān)察皮膚移植物存活情況，運(yùn)用有限稀釋混合淋巴細(xì)胞

3、培養(yǎng)方法估計(jì)輔助性T淋巴細(xì)胞前體(HTLp)和細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞前體(CTLp)的頻數(shù)。3.將BALB/c(H-2d)小鼠皮膚移植于C57BL/6(H-2b，B6)小鼠，同時(shí)經(jīng)尾靜脈注射BALB/c小鼠骨髓細(xì)胞和腺病毒AdCTLA4-FasL，術(shù)后4周每天注射環(huán)孢素A(CsA)或霉酚酸酯(MMF)；然后觀(guān)察移植皮膚存活情況，通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定受體外周血Vβ11+的T細(xì)胞的水平和供體來(lái)源細(xì)胞的嵌合水平，通過(guò)單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)了解對(duì)供體抗原

4、的耐受狀態(tài)。 [結(jié)果]1.重組腺病毒AdCTLA4-FasL的DNA通過(guò)PacI酶切證實(shí)為同源重組后的腺病毒，用特異引物經(jīng)PCR證實(shí)含有外源基因CTLA4-FasL，WesternBolt表明細(xì)胞感染重組腺病毒AdCTLA4-FasL后能表達(dá)分泌性的融合蛋白CTLA4-FasL。2.腺病毒AdCTLA4-FasL能夠在小鼠體內(nèi)表達(dá)CTLA4-FasL融合蛋白，持續(xù)約56天左右，且無(wú)明顯肝細(xì)胞毒性。該聯(lián)合方案誘導(dǎo)了持久(140d時(shí)

5、供體細(xì)胞＞20％)宏嵌合體(macrochimerism)；同時(shí)這種嵌合體促進(jìn)了穩(wěn)定的供體特異性耐受，BALB/c小鼠的皮膚移植物在B6受體小鼠中長(zhǎng)期存活[themeansurvivaltime(MST)＞200d]，而來(lái)源于C3H小鼠的第三者皮膚移植物被該嵌合體小鼠正常排斥。該聯(lián)合方案處理的B6小鼠在接受皮膚移植14天后，輔助性T淋巴細(xì)胞前體(HTLp)和細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞前體(CTLp)的頻數(shù)降低到很低的水平，表明AdCTLA4-Fa

6、sL能夠迅速促進(jìn)全面的外周耐受，從而有利于供體骨髓細(xì)胞植入。接受皮膚移植140天后，供體皮膚僅在形成長(zhǎng)期嵌合體的受體小鼠中繼續(xù)存活，這些小鼠體內(nèi)供體特異性的HTLp和CTLp的頻數(shù)減少，提示長(zhǎng)期的皮膚移植物耐受與穩(wěn)定的混合嵌合體有關(guān)，中樞性T細(xì)胞刪除可能是耐受維持的主要機(jī)制。3.聯(lián)合方案處理后短期加用免疫抑制藥物均促進(jìn)早期供體骨髓細(xì)胞植入；但單用CsA或CsA與MMF聯(lián)用的受體小鼠在皮膚移植后140d時(shí)混合嵌合降低到很低水平；單用CsA

7、或CsA與MMF聯(lián)用的受體小鼠中供體皮膚平均生存時(shí)間顯著低于不用免疫抑制藥物或用MMF的受體小鼠(p＜0.05)；皮膚移植后21d時(shí)CsA或CsA與MMF聯(lián)用的受體小鼠Vβ11+的T細(xì)胞水平顯著高于不用免疫抑制藥物或用MMF的受體小鼠(p＜0.05)；皮膚移植后150d時(shí)CsA或CsA與MMF聯(lián)用的受體小鼠脾細(xì)胞未顯示對(duì)同種抗原特異性耐受。 [結(jié)論]1.成功制備具有完整功能和感染能力的重組腺病毒AdCTLA4-FasL。2.Ad