聯(lián)合應(yīng)用抗原遞呈分子基因的漢坦病毒嵌合基因重組腺病毒的構(gòu)建及表達(dá)產(chǎn)物鑒定.pdf

1、腎綜合征出血熱（hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS）是由漢坦病毒（Hantavirus,HTV）引起，由鼠類等傳播的自然疫源性疾病，主要臨床特征為發(fā)熱、出血、腎臟損害，病死率高。我國是世界上腎綜合征出血熱疫情最嚴(yán)重的國家，年發(fā)病人數(shù)在2-5萬左右，且新疫區(qū)不斷出現(xiàn)，并時有暴發(fā)流行。臨床上目前尚缺乏特異有效的治療藥物，因此，HFRS嚴(yán)重威脅著人類的健康。
　　目前我國已經(jīng)成功研制出三

2、類出血熱滅活疫苗，包括乳鼠腦純化滅活疫苗（HTN型）、細(xì)胞培養(yǎng)滅活單價疫苗（沙鼠腎細(xì)胞HTN型疫苗、地鼠腎細(xì)胞SEO型疫苗）和雙價疫苗（HTN型和SEO型）。雖然滅活疫苗的研制成功對預(yù)防HFRS的發(fā)生和流行起到了積極作用，但通過使用發(fā)現(xiàn)該類疫苗仍存在一些問題：主要是其不能有效地刺激細(xì)胞免疫應(yīng)答，此外誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的能力也較弱，抗體滴度不高。因此研制更為有效的疫苗是預(yù)防HFRS發(fā)生和流行急需解決的問題。
　　HFRS的病原體為

3、漢坦病毒，屬于布尼亞病毒科（Bunyaviridae），漢坦病毒屬（Hantavirus），是一類有包膜分節(jié)段的單負(fù)鏈RNA病毒，基因組包括L、M、S3個片段，分別編碼RNA聚合酶、包膜糖蛋白（glycoprotein,GP）G1和G2、核衣殼蛋白（nucleocapsid,NP）。
　　M基因編碼的GP可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性中和抗體，且中和抗原位點(diǎn)主要位于G2糖蛋白上。S基因編碼的NP上亦分布有多個抗原表位，此外，NP還可誘導(dǎo)機(jī)體

4、產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)，參與機(jī)體對病毒的清除。研究表明GP的免疫原性較弱，誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體出現(xiàn)較晚且滴度不高。而NP是漢坦病毒結(jié)構(gòu)蛋白中免疫原性最強(qiáng)的，其刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體出現(xiàn)早，滴度高，且可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)。因此將二者融合表達(dá)，有望達(dá)到優(yōu)勢互補(bǔ)的目的。
　　在之前的研究中，我們將M基因與S基因的0.7Kb片段進(jìn)行了融合表達(dá)，用嵌合基因免疫小鼠，可刺激小鼠同時產(chǎn)生針對病毒的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。然而在研究中我們也發(fā)現(xiàn)了一

5、些問題，如盡管利用各種系統(tǒng)均能表達(dá)出完整的融合蛋白，但總的來說蛋白表達(dá)量還是偏低。此外，免疫小鼠后雖然各表達(dá)系統(tǒng)均能刺激機(jī)體產(chǎn)生體液及細(xì)胞免疫應(yīng)答，且腺病毒表達(dá)系統(tǒng)的效果要優(yōu)于其他系統(tǒng)，但是整體的免疫水平還不十分理想。因此，進(jìn)一步選擇合適的表達(dá)載體、優(yōu)化表達(dá)系統(tǒng)并使抗原分子更為有效的遞呈，以提高嵌合基因的表達(dá)量及其刺激機(jī)體免疫應(yīng)答的能力，是目前HFRS基因工程疫苗研究中急需解決的問題。之前，我們已經(jīng)將腺病毒表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)進(jìn)行了優(yōu)

6、化，即引入CAG啟動子與WPRE轉(zhuǎn)錄后調(diào)控序列。實驗發(fā)現(xiàn)，使用CAG后，腺病毒中嵌合基因的表達(dá)水平提高兩倍左右且高于單獨(dú)或同時使用WPRE組。本課題擬在前期已優(yōu)化轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，聯(lián)合應(yīng)用抗原加工遞呈分子基因HSP70C（熱休克蛋白70氨基端片段編碼基因）與Ub基因，以進(jìn)一步提高嵌合基因表達(dá)抗原的加工和提呈，特別是進(jìn)一步提高刺激體液以及細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力。
　　1.轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建
　　依據(jù)Genbank序列，設(shè)計引物，P

7、CR擴(kuò)增得到HSP70C基因和Ub基因并分別克隆入Teasy載體測序驗證其正確性。隨后將HSP70C和Ub分別插入pShuttle-G1S0.7-CAG.、pShuttle-G2S0.7-CAG中，重組的轉(zhuǎn)移載體經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后，瓊脂糖凝膠電泳分析，陽性克隆命名為pShuttle-G1S0.7-CAG-HSP70C、pShuttle-G2S0.7-HSP70C、pShuttle-G1S0.7-CAG-Ub、pShuttle-G1S0

8、.7-CAG-Ub。
　　2.重組腺病毒DNA的構(gòu)建
　　將重組的轉(zhuǎn)移載體用PI-SceⅠ和I-CeuⅠ酶切后與Adeno-XTMViralDNA連接，利用PCR鑒定重組的腺病毒DNA。
　　3.重組腺病毒的包裝及鑒定
　　將含目的片段的重組腺病毒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行大量擴(kuò)增純化，并測定濃度。利用PacⅠ線性化重組腺病毒DNA后轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。觀察細(xì)胞的CPE現(xiàn)象，通過反復(fù)凍融裂解細(xì)胞獲得病毒原種。取病毒

9、原種加入感染HEK293細(xì)胞，獲得病毒初次擴(kuò)增產(chǎn)物，并用PCR法鑒定重組腺病毒。
　　4.重組腺病毒的純化與滴度測定
　　用病毒初次擴(kuò)增產(chǎn)物感染單層HEK293細(xì)胞，將瓊脂糖凝膠與DMED混合物覆蓋其上，進(jìn)行噬斑實驗。待出現(xiàn)噬斑后，挑取單斑獲得純病毒。從單層細(xì)胞的一個單斑中獲得病毒并擴(kuò)大培養(yǎng)。利用終點(diǎn)稀釋法測病毒的滴度，純化后的重組腺病毒滴度達(dá)109pfu/mL。
　　5.重組腺病毒表達(dá)產(chǎn)物的鑒定
　　以100p

10、fu/cell的MOI感染HEK293細(xì)胞，在24-48h檢測細(xì)胞中蛋白的表達(dá)。免疫熒光結(jié)果表明，重組腺病毒感染的HEK293細(xì)胞均可被抗?jié)h坦病毒NP的特異性mAb1A8所識別。重組腺病毒Ad-G1S0.7-CAG-HSP70C及Ad-G2S0.7-CAG-HSP70C感染的HEK293細(xì)胞可被HSP70的特異性抗體識別，重組腺病毒Ad-G1S0.7-CAG-Ub及Ad-G2S0.7-CAG-Ub感染的HEK293細(xì)胞可被Ub的特異性抗