聯(lián)合應用抗原遞呈分子基因的漢坦病毒嵌合基因重組腺病毒的構建及表達產物鑒定.pdf

1、腎綜合征出血熱（hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS）是由漢坦病毒（Hantavirus,HTV）引起，由鼠類等傳播的自然疫源性疾病，主要臨床特征為發(fā)熱、出血、腎臟損害，病死率高。我國是世界上腎綜合征出血熱疫情最嚴重的國家，年發(fā)病人數在2-5萬左右，且新疫區(qū)不斷出現(xiàn)，并時有暴發(fā)流行。臨床上目前尚缺乏特異有效的治療藥物，因此，HFRS嚴重威脅著人類的健康。
　　目前我國已經成功研制出三

2、類出血熱滅活疫苗，包括乳鼠腦純化滅活疫苗（HTN型）、細胞培養(yǎng)滅活單價疫苗（沙鼠腎細胞HTN型疫苗、地鼠腎細胞SEO型疫苗）和雙價疫苗（HTN型和SEO型）。雖然滅活疫苗的研制成功對預防HFRS的發(fā)生和流行起到了積極作用，但通過使用發(fā)現(xiàn)該類疫苗仍存在一些問題：主要是其不能有效地刺激細胞免疫應答，此外誘導機體產生中和抗體的能力也較弱，抗體滴度不高。因此研制更為有效的疫苗是預防HFRS發(fā)生和流行急需解決的問題。
　　HFRS的病原體為

3、漢坦病毒，屬于布尼亞病毒科（Bunyaviridae），漢坦病毒屬（Hantavirus），是一類有包膜分節(jié)段的單負鏈RNA病毒，基因組包括L、M、S3個片段，分別編碼RNA聚合酶、包膜糖蛋白（glycoprotein,GP）G1和G2、核衣殼蛋白（nucleocapsid,NP）。
　　M基因編碼的GP可誘導機體產生特異性中和抗體，且中和抗原位點主要位于G2糖蛋白上。S基因編碼的NP上亦分布有多個抗原表位，此外，NP還可誘導機體

4、產生強烈的細胞免疫反應，參與機體對病毒的清除。研究表明GP的免疫原性較弱，誘導產生的抗體出現(xiàn)較晚且滴度不高。而NP是漢坦病毒結構蛋白中免疫原性最強的，其刺激機體產生的抗體出現(xiàn)早，滴度高，且可誘導機體產生免疫保護。因此將二者融合表達，有望達到優(yōu)勢互補的目的。
　　在之前的研究中，我們將M基因與S基因的0.7Kb片段進行了融合表達，用嵌合基因免疫小鼠，可刺激小鼠同時產生針對病毒的特異性體液免疫和細胞免疫反應。然而在研究中我們也發(fā)現(xiàn)了一

5、些問題，如盡管利用各種系統(tǒng)均能表達出完整的融合蛋白，但總的來說蛋白表達量還是偏低。此外，免疫小鼠后雖然各表達系統(tǒng)均能刺激機體產生體液及細胞免疫應答，且腺病毒表達系統(tǒng)的效果要優(yōu)于其他系統(tǒng)，但是整體的免疫水平還不十分理想。因此，進一步選擇合適的表達載體、優(yōu)化表達系統(tǒng)并使抗原分子更為有效的遞呈，以提高嵌合基因的表達量及其刺激機體免疫應答的能力，是目前HFRS基因工程疫苗研究中急需解決的問題。之前，我們已經將腺病毒表達系統(tǒng)的轉錄調控結構進行了優(yōu)

6、化，即引入CAG啟動子與WPRE轉錄后調控序列。實驗發(fā)現(xiàn)，使用CAG后，腺病毒中嵌合基因的表達水平提高兩倍左右且高于單獨或同時使用WPRE組。本課題擬在前期已優(yōu)化轉錄調控結構的基礎上，聯(lián)合應用抗原加工遞呈分子基因HSP70C（熱休克蛋白70氨基端片段編碼基因）與Ub基因，以進一步提高嵌合基因表達抗原的加工和提呈，特別是進一步提高刺激體液以及細胞免疫應答的能力。
　　1.轉移載體的構建
　　依據Genbank序列，設計引物，P

7、CR擴增得到HSP70C基因和Ub基因并分別克隆入Teasy載體測序驗證其正確性。隨后將HSP70C和Ub分別插入pShuttle-G1S0.7-CAG.、pShuttle-G2S0.7-CAG中，重組的轉移載體經限制性內切酶消化后，瓊脂糖凝膠電泳分析，陽性克隆命名為pShuttle-G1S0.7-CAG-HSP70C、pShuttle-G2S0.7-HSP70C、pShuttle-G1S0.7-CAG-Ub、pShuttle-G1S0

8、.7-CAG-Ub。
　　2.重組腺病毒DNA的構建
　　將重組的轉移載體用PI-SceⅠ和I-CeuⅠ酶切后與Adeno-XTMViralDNA連接，利用PCR鑒定重組的腺病毒DNA。
　　3.重組腺病毒的包裝及鑒定
　　將含目的片段的重組腺病毒DNA轉化大腸桿菌進行大量擴增純化，并測定濃度。利用PacⅠ線性化重組腺病毒DNA后轉染HEK293細胞。觀察細胞的CPE現(xiàn)象，通過反復凍融裂解細胞獲得病毒原種。取病毒

9、原種加入感染HEK293細胞，獲得病毒初次擴增產物，并用PCR法鑒定重組腺病毒。
　　4.重組腺病毒的純化與滴度測定
　　用病毒初次擴增產物感染單層HEK293細胞，將瓊脂糖凝膠與DMED混合物覆蓋其上，進行噬斑實驗。待出現(xiàn)噬斑后，挑取單斑獲得純病毒。從單層細胞的一個單斑中獲得病毒并擴大培養(yǎng)。利用終點稀釋法測病毒的滴度，純化后的重組腺病毒滴度達109pfu/mL。
　　5.重組腺病毒表達產物的鑒定
　　以100p

10、fu/cell的MOI感染HEK293細胞，在24-48h檢測細胞中蛋白的表達。免疫熒光結果表明，重組腺病毒感染的HEK293細胞均可被抗?jié)h坦病毒NP的特異性mAb1A8所識別。重組腺病毒Ad-G1S0.7-CAG-HSP70C及Ad-G2S0.7-CAG-HSP70C感染的HEK293細胞可被HSP70的特異性抗體識別，重組腺病毒Ad-G1S0.7-CAG-Ub及Ad-G2S0.7-CAG-Ub感染的HEK293細胞可被Ub的特異性抗