漢坦病毒復(fù)合型多表位重組腺病毒的構(gòu)建及免疫學(xué)特性研究.pdf

1、腎綜合征出血熱（HFRS）是一種由漢坦病毒引起的急性傳染病，臨床上以發(fā)熱、出血和急性腎功能損害為主要特征。我國是HFRS危害最嚴重的國家，年發(fā)病人數(shù)為5～10萬人，其流行范圍廣、發(fā)病人數(shù)多、病死率較高。臨床上尚缺乏特異有效的治療方法。國內(nèi)外近年來雖已研制出HFRS的滅活疫苗，但從部分人群試用的情況來看，該類疫苗還存在明顯不足，尤其是不能有效地刺激細胞免疫應(yīng)答。因此仍需針對滅活疫苗存在的不足，進一步研究更為有效的HFRS新型疫苗。

2、　　漢坦病毒是一種有囊膜的單股負鏈RNA病毒，基因組分為L、M、S三個節(jié)段，分別編碼病毒的RNA依賴的RNA聚合酶、包膜糖蛋白（G1和G2）以及核衣殼蛋白（NP）。以往研究表明，漢坦病毒的M基因編碼的包膜糖蛋白（GP）可刺激機體產(chǎn)生中和抗體，而對感染動物和人體起到保護作用；但GP免疫原性較弱，刺激產(chǎn)生的抗體出現(xiàn)晚，滴度不高。NP是該病毒結(jié)構(gòu)蛋白中免疫原性最強的，其刺激機體產(chǎn)生的特異性抗體出現(xiàn)早、滴度高、維持時間長，并且還有誘導(dǎo)機體細胞免

3、疫應(yīng)答的作用。由于漢坦病毒中和抗原表位主要存在于病毒GP上，目前HFRS基因工程疫苗的基礎(chǔ)研究主要集中于GP。該方面的研究雖已取得較大進展，但由于GP相對較弱的免疫原性，故免疫效果仍不理想。國內(nèi)外研究表明，漢坦病毒GP和NP在誘導(dǎo)機體免疫應(yīng)答中可能均起重要作用，因此，如何發(fā)揮其不同結(jié)構(gòu)蛋白在誘導(dǎo)機體免疫應(yīng)答中的優(yōu)勢互補作用，是HFRS基因工程疫苗研究中亟待解決的問題。
　　本室前期曾將漢灘病毒（HTNV）76-118株的M基因分別

4、與編碼NP氨基端aa1～247的S基因片段（S0.7，編碼NP主要抗原區(qū)段）拼接，利用桿狀病毒和腺病毒表達系統(tǒng)進行融合表達以及表達產(chǎn)物的免疫學(xué)分析。結(jié)果證實HTNV76-118株G1S0.7和G2S0.7嵌合基因均能刺激機體的體液免疫和細胞免疫應(yīng)答。然而在研究中我們也發(fā)現(xiàn)了一些問題，如盡管免疫小鼠后各表達系統(tǒng)均能刺激機體產(chǎn)生體液及細胞免疫應(yīng)答，且腺病毒表達系統(tǒng)的效果要優(yōu)于其他系統(tǒng)，但是整體的免疫水平還不十分理想，特別是刺激機體細胞免疫應(yīng)

5、答的水平不高。國內(nèi)外已證實漢坦病毒感染后以CTL為主的T細胞應(yīng)答對于機體保護有重要作用，因此利用漢坦病毒CTL表位結(jié)合結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)建疫苗可能是一種可行的方案。
　　本研究在前期工作基礎(chǔ)上，利用基因重組技術(shù)，構(gòu)建了含有HTNVM基因（編碼糖蛋白G1、G2）和部分S基因（編碼NP主要抗原區(qū)段）以及S基因的多個CTL表位的多種重組腺病毒，在對這些重組腺病毒進行系統(tǒng)鑒定的基礎(chǔ)上，觀察了其刺激小鼠體液免疫和細胞免疫應(yīng)答的能力。
　　1、

6、將HTNVG1S0.7和G2S0.7嵌合基因片段分別與合成的CTL表位串聯(lián)基因CTL1（表位間加間隔序列AAY）及CTL2（表位間不加間隔序列AAY）以不同組合方式克隆到腺病毒轉(zhuǎn)移載體pShuttle中，CTL表位拼接于S0.73’端，通過酶切鑒定選取陽性克隆，分別命名為pG1S0.7CTL1、pG1S0.7CTL2、pG2S0.7CTL1、pG1S0.7CTL2。
　　2、通過特異性的I-CeuI和PI-SceI酶切后將重組轉(zhuǎn)移

7、載體與Adeno-X載體病毒DNA相連，電轉(zhuǎn)化E.coliJM109，并用PCR方法進行了篩選和鑒定，獲得重組腺病毒的DNA，轉(zhuǎn)染HEK293細胞得到重組腺病毒原種，分別命名為AG1S0.7CTL1、AG1S0.7CTL2、AG2S0.7CTL1、AG1S0.7CTL2。
　　3、將各重組腺病毒經(jīng)CsCl密度梯度離心純化及測定滴度后分別感染HEK293和Vero-E6細胞。IFA和ELISA檢測結(jié)果顯示，各重組腺病毒均可在細胞中表

8、達相應(yīng)HTNV抗原，表明CTL表位的插入并沒有影響相應(yīng)抗原的表達及其與特異性單克隆抗體（mAb）的結(jié)合活性。Western-blot分析結(jié)果顯示，各重組腺病毒組在HEK293細胞中均可表達能與特異性mAb產(chǎn)生反應(yīng)、相對分子質(zhì)量（Mr）分別約為97KDa和80KDa的融合蛋白，與預(yù)期融合蛋白大小相符，表明重組腺病毒在HEK293細胞中表達的為完整的融合蛋白。
　　4、以各重組腺病毒分別經(jīng)腹腔注射免疫Balb/c小鼠，通過IFA、EL

9、ISA、微量細胞中和試驗、T淋巴細胞增殖試驗、CTL殺傷試驗、細胞因子檢測等方法觀察免疫效果。結(jié)果表明，各重組腺病毒免疫小鼠均可刺激機體產(chǎn)生低滴度的抗NP（1160∶～1320∶）和抗GP抗體（1∶20～1∶40），同時也可產(chǎn)生效價約1∶5～1∶40的低滴度中和抗體。各重組腺病毒均可誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)特異的細胞免疫應(yīng)答，其中AG2S0.7CTL1免疫組小鼠脾細胞對NP及GP的增殖指數(shù)明顯高于對照組；AG1S0.7CTL2、AG2S0.7CTL

10、1、AG2S0.7CTL2組增殖指數(shù)也都略高于AG1S0.7和AG2S0.7組，表明加有CTL多表位的重組腺病毒能更有效地刺激小鼠的細胞免疫應(yīng)答。CTL殺傷試驗的結(jié)果表明，各重組腺病毒免疫組在不同的效/靶比條件下均可誘導(dǎo)針對靶細胞的特異性殺傷效應(yīng)，并隨著效/靶比的提高，殺傷效應(yīng)也相應(yīng)提高；其中含有CTL多表位的四種重組腺病毒免疫所誘導(dǎo)的CTL殺傷效應(yīng)明顯高于不含CTL表位的兩種重組腺病毒。對在CTL多表位間加入或不加入間隔序列AAY的各