我國(guó)Irkut病毒馴化及其糖蛋白重組腺病毒免疫特性研究.pdf

1、狂犬病是一種高致死性人獸共患傳染病，主要由彈狀病毒科（Rhabodoviridea）狂犬病毒屬（Lyssavirus）成員感染哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起。目前，狂犬病毒的種類有15種，除MOKV和IKOV外，其余13種病毒均以蝙蝠為主要儲(chǔ)存宿主。我國(guó)迄今唯一一株蝙蝠狂犬病毒是由筆者所在實(shí)驗(yàn)室于2012年從吉林省分離得到。該病毒IRKV-THChina12是狂犬病毒屬（Lyssaivrus）伊爾庫(kù)特河病毒（Irkut virus，IRKV）

2、分離株。進(jìn)一步研究表明，其與我國(guó)廣泛流行的基因I型狂犬病病毒（Rabies virus，RABV），在基因序列、致病性和免疫原性方面，均存在明顯差異。有研究報(bào)道，目前市售的狂犬病生物制品（疫苗和抗體）只能通過(guò)暴露前預(yù)防接種阻斷IRKV感染，但不能提供有效的暴露后免疫保護(hù)。IRKV與RABV之間，僅存在部分免疫交叉。因此，有必要開(kāi)展我國(guó)蝙蝠狂犬病毒的細(xì)胞馴化及免疫原性研究，從而為特異性預(yù)防制品開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。
　　本研究通過(guò)對(duì)IRKV

3、-THChina12適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)前后全基因組序列對(duì)比分析，并與多個(gè)不同種屬狂犬病毒株的氨基酸比對(duì)，分析了我國(guó)伊爾庫(kù)特河病毒IRKV-THChina12株適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)后的分子生物學(xué)特性。結(jié)果顯示，適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)后共發(fā)生11個(gè)核苷酸突變并造成5個(gè)氨基酸突變，其中1個(gè)氨基酸變異發(fā)生在P蛋白負(fù)責(zé)與LC8相互作用的區(qū)域，2個(gè)氨基酸突變發(fā)生在M蛋白編碼區(qū)，1個(gè)氨基酸突變發(fā)生在G（333位精氨酸未改變）蛋白編碼區(qū)，L蛋白僅有1個(gè)氨基酸突變。以上表明，可

4、能多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白同時(shí)決定了病毒在 Vero細(xì)胞的適應(yīng)性。明確本細(xì)胞適應(yīng)毒株的分子生物學(xué)特性，為在細(xì)胞水平開(kāi)展相關(guān)科學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。
　　選取IRKV-THChina12病毒分離株的G基因?yàn)榘谢?，?gòu)建了表達(dá)IRKV糖蛋白的重組人5型腺病毒活載體疫苗，并命名為rAd5-IRKV-G。Western-blot和間接免疫熒光試驗(yàn)證明，IRKV-THChina12的G蛋白在重組腺病毒感染的293AD細(xì)胞中得到表達(dá)。將rAd5-IRKV-G

5、對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔免疫和肌肉免疫，同時(shí)設(shè)立wt-rAd5對(duì)照，實(shí)驗(yàn)表明兩組免疫方式均誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗IRKV中和抗體，且rAd5-IRKV-G組與wt-rAd5組差異顯著（p≤0.05），腹腔組與肌肉組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。對(duì)金黃地鼠單次免疫和兩次免疫實(shí)驗(yàn)表明，兩組均誘導(dǎo)地鼠產(chǎn)生抗IRKV中和抗體，且兩組平均中和抗體效價(jià)差異不顯著（P＞0.05）。
　　試驗(yàn)結(jié)果表明，本研究初步明確了IRKV-THChina12細(xì)胞培養(yǎng)的分子生物學(xué)