重組犬2型腺病毒及其免疫研究——攜帶狂犬病病毒糖蛋白膜外區(qū)基因的活載體疫苗.pdf

1、狂犬病(Rabies)近年來(lái)在我國(guó)呈快速上升勢(shì)頭，據(jù)衛(wèi)生部公布的數(shù)據(jù)表明，2001年全國(guó)狂犬病死亡人數(shù)891例；2002年全國(guó)狂犬病死亡人數(shù)1122例；2003年全國(guó)狂犬病死亡人數(shù)2037例；2004年全國(guó)狂犬病死亡人數(shù)2651例；狂犬病正嚴(yán)重地危害人民的生命健康。人患狂犬病大部分是由帶毒犬咬傷引起的。目前我國(guó)用于狂犬病預(yù)防的疫苗主要是濃縮的滅活苗和弱毒活疫苗，前者由于制備成本昂貴，主要在發(fā)達(dá)城市推廣使用；后者雖然相對(duì)便宜，但存在毒力返

2、祖的潛在危險(xiǎn)；因此研制安全、有效、廉價(jià)的犬用狂犬病疫苗具有重要的實(shí)際意義。 狂犬病病毒是狂犬病的病原體，屬?gòu)棤畈《究?、狂犬病病毒屬，是單股?fù)鏈RNA病毒，其基因組分別編碼N、NS、M、G、L五種蛋白，其中糖蛋白(N)是狂犬病病毒中唯一能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的成分，且抗原表位都集中在膜外區(qū)部分?；钶d體疫苗具有成本低、效果好和使用安全、方便等諸多優(yōu)點(diǎn)。犬2型腺病毒(CanineAdenovirustype2，CAV-2)弱毒株是批準(zhǔn)

3、用于犬傳染性肝炎和犬傳染性喉氣管炎免疫預(yù)防的疫苗株。CAV-2有四個(gè)早期轉(zhuǎn)錄區(qū)，其中E3區(qū)是病毒復(fù)制的非必需區(qū)，缺失或插入外源基因不會(huì)影響病毒的復(fù)制。因此，CAV-2具有發(fā)展成為活疫苗載體的潛力。 本研究旨在通過(guò)基因工程手段構(gòu)建一種新型的活載體狂犬病疫苗，這種疫苗以犬的2型腺病毒為載體，在其基因組中加入狂犬病病毒的保護(hù)性抗原基因—狂犬病病毒糖蛋白的膜外區(qū)部分，當(dāng)重組病毒感染犬時(shí)，它所攜帶的狂犬病病毒糖蛋白基因隨之進(jìn)入犬的細(xì)胞中并

4、表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白，刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)狂犬病病毒的免疫應(yīng)答，從而使被免疫動(dòng)物產(chǎn)生對(duì)狂犬病病毒的保護(hù)力。 本研究通過(guò)RT-PCR技術(shù)從狂犬病病毒SRV9株細(xì)胞毒擴(kuò)增得到狂犬病病毒糖蛋白膜外區(qū)序列，以其為目的基因克隆入pEGFP-C1，取代其中綠色熒光蛋白基因，獲得了以CMV為啟動(dòng)子、SV40polyA為終止信號(hào)的表達(dá)載體pERVG2；以AseⅠ&MluⅠ雙酶切游離表達(dá)盒，正、反向克隆入經(jīng)SspⅠ&DraⅢ雙酶切、部分缺失犬2型腺病

5、毒E3區(qū)的中間質(zhì)粒pVAX-E3中；再以改造后的E3區(qū)與犬2型腺病毒全基因組質(zhì)粒pCAV-2中的E3區(qū)進(jìn)行置換，獲得重組犬2型腺病毒基因組。以AscⅠ&ClaⅠ雙酶切，從質(zhì)粒中釋放出重組腺病毒全基因組，轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞，分別獲得了克隆有糖蛋白膜外區(qū)正、反向表達(dá)盒的重組犬2型腺病毒。兩株重組腺病毒免疫幼犬，初步的動(dòng)物免疫結(jié)果顯示，無(wú)論表達(dá)盒是正向還是反向插入基因組，糖蛋白膜外區(qū)在犬體內(nèi)均得到了有效表達(dá)，產(chǎn)生了針對(duì)狂犬病病毒的免疫應(yīng)答。但正