狂犬病病毒磷蛋白調(diào)控狂犬病病毒復(fù)制的分子機(jī)制研究.pdf

1、狂犬病病毒(Rabies virus，RABV)隸屬于彈狀病毒科(Rhabdovidae family)基因1型狂犬病病毒屬成員病毒(Lyssavirus)，是人和動(dòng)物狂犬病的病原體。如今世界范圍內(nèi)狂犬病病毒屬的成員主要有七個(gè)基因型:基因1型(狂犬病病毒，RABV)，基因2型（Lagos蝙蝠病毒，LBV），基因3型（Mokola病毒，MOKV），基因4型（Duvenhage病毒，DUVV），基因5型(歐洲蝙蝠1型狂犬病病毒，EBLV-1

2、)，基因6型(歐洲蝙蝠2型狂犬病病毒，EBLV-2)，基因7型(澳大利亞蝙蝠狂犬病病毒，ABLV)。其中基因1型狂犬病病毒RABV對(duì)人和動(dòng)物帶來(lái)的危害最嚴(yán)重。其病毒結(jié)構(gòu)蛋白磷蛋白(P)作為一種多功能的非蛋白激酶蛋白，能夠參與病毒的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制，也是狂犬病病毒的一種干擾素拮抗因子。迄今為止，雖有諸多研究表明P蛋白既能與RABV本身的病毒結(jié)構(gòu)蛋白又能與宿主細(xì)胞蛋白互作并參與RABV的感染，但這方面的數(shù)據(jù)還是相當(dāng)有限，該病毒的致病機(jī)制還遠(yuǎn)未明了

3、。本研究闡明了細(xì)胞周期蛋白37(Cdc37)依賴(lài)和非依賴(lài)熱休克蛋白90(Hsp90)結(jié)合的途徑穩(wěn)定P蛋白促進(jìn)RABV感染的分子機(jī)制，旨在為將來(lái)抗RABV新藥物靶標(biāo)的研究開(kāi)發(fā)提供可供參考的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　1.P蛋白作為Hsp90客戶(hù)蛋白的發(fā)現(xiàn)
　　前期研究發(fā)現(xiàn)RABV感染過(guò)程中Hsp90能夠被募集至病毒轉(zhuǎn)錄與復(fù)制場(chǎng)所內(nèi)基氏小體(Negri bodies，NBs)中，提示Hsp90可能涉及RABV的感染。因此本研究以鼠神經(jīng)瘤母細(xì)

4、胞N2a為RABV感染模型，以基因1型疫苗毒株HEP-Flury為主要實(shí)驗(yàn)毒株，首先采用Hsp90特異性抑制劑分析其對(duì)RABV感染的影響。Hsp90抑制劑格爾德霉素(GA)及其衍生物烯丙基氨基格爾德霉素(17-AAG)的處理能夠降低細(xì)胞內(nèi)RABV病毒蛋白的累積水平、病毒的復(fù)制水平、病毒各基因的轉(zhuǎn)錄水平以及病毒的滴度。Hsp90抑制劑17-AAG的處理并不能影響蛋白合成抑制劑放線菌酮(CHX)對(duì)RABV N蛋白基因mRNA水平的抑制作用。

5、由此提示，Hsp90影響RABV感染可能是通過(guò)影響病毒蛋白穩(wěn)定性引發(fā)，而不是由其直接影響病毒基因的轉(zhuǎn)錄或mRNA的穩(wěn)定性導(dǎo)致。
　　然而Hsp90通過(guò)何種途徑影響病毒蛋白穩(wěn)定性？是否是通過(guò)蛋白酶體途徑和自噬途徑？為了驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)，本研究通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蛋白酶體抑制劑MG-132的處理未能抑制17-AAG對(duì)RABV病毒蛋白N和P的降解作用，而自噬阻斷劑wortmannin的處理可阻斷17-AAG對(duì)RABV病毒蛋白N和P的降解作

6、用。由此提示，Hsp90抑制劑降解RABV病毒蛋白N和P可能是通過(guò)自噬途徑進(jìn)行。為了確證Hsp90抑制劑降解RABV病毒蛋白的自噬途徑以及避免wortmannin藥物的脫靶效應(yīng)，借助RNAi敲降試驗(yàn)證明自噬途徑關(guān)鍵成分LC3B的敲降同樣可阻斷17-AAG對(duì)RABV病毒蛋白N和P的降解作用。由此表明Hsp90抑制劑可引起RABV病毒蛋白N和/或P的自噬途徑降解。由此同時(shí)，本研究構(gòu)建了pSG5-N和pSG5-P兩個(gè)攜帶SV40啟動(dòng)子的真核表

7、達(dá)載體，證明了17-AAG能夠特異降解真核表達(dá)的P蛋白，而對(duì)真核表達(dá)N蛋白沒(méi)有影響。進(jìn)一步的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(Co-IP)結(jié)果表明，RABV天然性或外源性表達(dá)的P蛋白可與內(nèi)源性或外源性表達(dá)的Hsp90互作。此外，Co-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果又發(fā)現(xiàn)狂犬病病毒屬成員CVS-11、ABLV和MOKV三個(gè)毒株的P蛋白均能夠與Hsp90發(fā)生結(jié)合。Hsp90與P蛋白的互作是所有狂犬病病毒屬成員毒株共有的特性。由此表明，狂犬病病毒屬成員毒株P(guān)蛋白是Hsp90的客

8、戶(hù)蛋白。
　　2.Cdc37參與Hsp90-P復(fù)合物形成的發(fā)現(xiàn)
　　Hsp90對(duì)其客戶(hù)蛋白伴侶功能的發(fā)揮需要一大批輔助伴侶蛋白的支持。為了找尋參與Hsp90-P復(fù)合物形成的關(guān)鍵輔助伴侶蛋白，我們首先分析了Hsp90變構(gòu)體抑制劑Celastrol對(duì)RABV病毒蛋白累積的影響。免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Celastrol藥物具有類(lèi)似17-AAG藥物的作用也能夠降低RABV P蛋白累積水平。由此提示輔助伴侶蛋白Cdc37可能參與了Hs

9、p90-P復(fù)合物的形成。接著共聚焦實(shí)驗(yàn)顯示，RABV感染情況下含有P蛋白的NBs能夠大量募集Cdc37;Co-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步顯示Hsp90-Cdc37-P三元復(fù)合物的形成。由此表明，P蛋白是Hsp90/Cdc37伴侶系統(tǒng)的客戶(hù)蛋白。
　　3.Cdc37募集P蛋白至Hsp90系統(tǒng)依賴(lài)和非依賴(lài)Hsp90結(jié)合途徑的發(fā)現(xiàn)
　　已有研究報(bào)道Cdc37募集蛋白激酶至Hsp90系統(tǒng)存在依賴(lài)和非依賴(lài)Hsp90結(jié)合的途徑。而Cdc37對(duì)其

10、他種類(lèi)客戶(hù)蛋白的募集途徑不甚明了。那作為非蛋白激酶的RABV P蛋白，Cdc37對(duì)其募集至Hsp90系統(tǒng)是否也存在這兩條途徑或其他途徑？在本研究中我們證明Cdc37參與Hsp90-P復(fù)合物形成的四條途徑:缺失Hsp90結(jié)合區(qū)域的Cdc37截短體未能提升P蛋白的累積水平，而野生型Cdc37和Cdc37截短體Cdc37(aa1-323)能夠通過(guò)依賴(lài)Hsp90結(jié)合的途徑募集P蛋白至Hsp90系統(tǒng)進(jìn)而促進(jìn)P蛋白的累積;破壞了與Hsp90結(jié)合能力

11、的Cdc37 M165和L206單點(diǎn)和雙點(diǎn)突變體依然保持著與P蛋白的互作，并提升P蛋白的累積水平，而且能夠模擬野生型Cdc37增強(qiáng)Hsp90-P之間的互作，由此指示野生型Cdc37還能夠以一種非依賴(lài)Hsp90結(jié)合的方式募集P蛋白至Hsp90系統(tǒng)來(lái)保護(hù)P蛋白的穩(wěn)定性;Cdc37的激活需要其Ser13位點(diǎn)的磷酸化修飾，非激活的Cdc37（將Cdc37 Ser13位點(diǎn)突變成Ala）并未減弱其與Hsp90和P蛋白的互作，而且能夠募集P蛋白至Hs

12、p90系統(tǒng)進(jìn)而促進(jìn)P蛋白的累積，由此指示非激活的Cdc37存在類(lèi)似于野生型Cdc37依賴(lài)Hsp90結(jié)合的方式募集P蛋白至Hsp90系統(tǒng)進(jìn)而對(duì)P蛋白進(jìn)行穩(wěn)定;破壞了與Hsp90結(jié)合能力的非激活Cdc37 M165和L206的單點(diǎn)和雙點(diǎn)突變體也依然保持著與P蛋白的互作，并提升P蛋白的累積水平，而且能夠模擬野生型Cdc37增強(qiáng)Hsp90-P之間的互作，由此指示非激活的Cdc37也能夠以一種非依賴(lài)Hsp90結(jié)合的方式募集P蛋白至Hsp90系統(tǒng)來(lái)

13、保護(hù)P蛋白的穩(wěn)定性。
　　4.Cdc37、Hsp90穩(wěn)定P蛋白正調(diào)控RABV感染的發(fā)現(xiàn)
　　首先免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示RABV的感染能夠誘導(dǎo)Cdc37和Hsp90蛋白的表達(dá)，由此提示Cdc37和Hsp90在RABV感染過(guò)程中可能起著正向調(diào)控作用。接著，采用真核過(guò)表達(dá)的方式研究Cdc37和Hsp90對(duì)RABV感染的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)Hsp90和Cdc37能夠從蛋白水平引起RABV病毒P蛋白的累積。然后我們通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)

14、，過(guò)表達(dá)Cdc37和Hsp90能夠阻斷蛋白合成抑制劑CHX處理情況下的P蛋白降解，而對(duì)CHX處理情況下的N蛋白的降解無(wú)影響，由此表明Cdc37和Hsp90是從蛋白穩(wěn)定性水平而不是從蛋白合成水平影響RABV病毒P蛋白的累積。
　　此外，采用RNAi干擾的方法降低Cdc37或Hsp90蛋白的表達(dá)能夠顯著降低病毒蛋白表達(dá)和病毒RNA合成的水平，并減少細(xì)胞內(nèi)病毒粒子的釋放量，由此證實(shí)了Cdc37和Hsp90在RABV感染的正向調(diào)控作用。最