偽狂犬病病毒DNA聚合酶入核轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制.pdf

1、偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）又被稱為豬皰疹病毒1型或奧耶斯基病病毒，屬于皰疹病毒科α-皰疹病毒亞科水痘病毒屬。PRV可引起家畜和多種野生動(dòng)物發(fā)生偽狂犬病，其中豬是該病的主要宿主和傳染源。PRV在多個(gè)國家均有流行，對養(yǎng)豬業(yè)危害極大，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。PRV DNA復(fù)制是一個(gè)復(fù)雜的過程，需要病毒編碼的多種酶蛋白協(xié)同參與，其中病毒DNA聚合酶發(fā)揮關(guān)鍵作用。PRV DNA聚合酶包含2個(gè)亞基：催化亞基UL30和輔

2、助亞基UL42。UL30具有天然的酶活性，能催化病毒 DNA的合成，而UL42能將聚合酶全酶固定在DNA模版上，增強(qiáng)全酶的持續(xù)合成能力。PRV DNA聚合酶在細(xì)胞質(zhì)合成后必須轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中才能發(fā)揮功能，這是啟動(dòng)病毒DNA復(fù)制的先決條件。然而，PRV DNA聚合酶入核轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制尚未闡明。作為PRV DNA聚合酶的輔助亞基，UL42是否是病毒復(fù)制所必需的也還不清楚。本研究旨在闡明PRV DNA聚合酶UL42與UL30亞基入核轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)

3、制，并明確輔助亞基UL42在PRV DNA復(fù)制過程中的作用。
　　為闡明PRV DNA聚合酶UL42與UL30亞基的入核通路，本研究經(jīng)免疫熒光試驗(yàn)證實(shí)，UL42能獨(dú)立定位于細(xì)胞核中，UL30主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，然而當(dāng)UL42與UL30共表達(dá)時(shí)，UL30的細(xì)胞質(zhì)定位完全轉(zhuǎn)移為細(xì)胞核定位，表明UL30的入核轉(zhuǎn)運(yùn)依賴于UL42。對UL42和UL30進(jìn)行缺失和定向突變分析發(fā)現(xiàn)，UL42在354～370位氨基酸包含一個(gè)功能性和可轉(zhuǎn)移性的雙分

4、型核定位信號（Nuclear localization signal，NLS），并證實(shí)K354、R355和K367是UL42雙分型NLS保持完整結(jié)構(gòu)和功能所必需的，然而UL30并無功能性NLS。免疫共沉淀試驗(yàn)結(jié)果表明，UL42與Importinα3（Impα3）和Impα4存在相互作用，且這一相互作用是由UL42雙分型NLS介導(dǎo)的。經(jīng)體外入核轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)證實(shí)，UL42的核定位是一個(gè)溫度、能量和受體依賴的過程，需要Impα和Impβ同時(shí)參與，

5、表明UL42是經(jīng)Impα/β通路入核的。當(dāng)缺失NLS的UL42突變體（UL42ΔNLS）與UL30共表達(dá)時(shí)，UL42ΔNLS/UL30異源二聚體被完全限制在細(xì)胞質(zhì)中，表明UL30利用UL42 NLS的功能入核。上述結(jié)果表明，PRV DNA聚合酶全酶復(fù)合體在細(xì)胞質(zhì)中裝配完成后，借助于UL42雙分型NLS的功能，經(jīng)Impα/β通路入核。
　　研究表明，PRV UL42能在體外刺激UL30的催化活性，且它是UL30的細(xì)胞核協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，

6、能在體外引導(dǎo)UL30入核，因此推測UL42是PRV復(fù)制的必需基因。本研究對PRV感染后UL42的表達(dá)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)UL42是PRV的一個(gè)早期基因，在病毒感染后5 h就能檢測到。根據(jù)UL42序列特征設(shè)計(jì)了3條特異性siRNAs，經(jīng)Western blot試驗(yàn)證實(shí)它們都能在體外有效地抑制UL42的表達(dá)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNAs后感染PRV，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這3條siRNAs能劑量依賴性地抑制病毒感染后UL42的表達(dá)，且在下調(diào)UL