豬偽狂犬病病毒microRNA文庫的構建及鑒定.pdf

1、豬偽狂犬病(Pseudorabies, PR)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)所引起的一種高度接觸性、急性傳染病。PRV屬皰疹病毒科(Herpesviridae)，α皰疹病毒亞科，該病在全球范圍內(nèi)給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。近期研究表明，一些皰疹病毒編碼的 miRNA在病毒復制與調節(jié)中起著至關重要的作用。MicroRNAs(miRNAs)是一種含有約22個核苷酸的非編碼單鏈 RNA分子，廣泛存在于人類

2、及其它各種生物中。它通過與靶 mRNA特異性的結合，引起靶mRNA降解或者抑制其翻譯，從而調節(jié)基因的轉錄后表達水平。偽狂犬病毒編碼 miRNA的研究才剛剛起步，因此，對偽狂犬病毒 miRNA的探討具有重要意義和學術價值。
　　本研究利用 PK-15細胞培養(yǎng)豬偽狂犬病毒，接毒后在不同時間階段收集病毒細胞培養(yǎng)物，分別提取不同時間段細胞培養(yǎng)物的總 RNA；變性聚丙乙烯酰胺凝膠分離出18-26nt的小片段 RNA，小 RNA分子兩端先后連

3、接生物接頭后進行反轉錄，PCR擴增后回收 DNA片段；將所獲得 DNA片段與質粒載體連接，將連接產(chǎn)物轉化工程菌，構建豬偽狂犬病病毒miRNA的cDNA文庫。從陽性克隆菌落中隨機挑取一些克隆，進行PCR擴增鑒定克隆的特性并測序，則得到20個大小正確的序列，結合生物信息學方法初步篩選出 miRNA。實驗結果表明，通過富集小分子RNA、反轉錄擴增小RNA分子，成功構建豬偽狂犬病病毒小分子RNA的 cDNA文庫。序列分析和偽狂犬病病毒生物信息學