表達(dá)弓形蟲SAG1偽狂犬病病毒的構(gòu)建及免疫研究.pdf

1、弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，能引起人獸共患的弓形蟲病。由于弓形蟲生活史復(fù)雜，傳播途徑多樣，對弓形蟲的治療，特別是弓形蟲包囊，迄今尚未有理想藥物。因此弓形蟲疫苗已成為弓形蟲病防治研究的重點(diǎn)。 為構(gòu)建表達(dá)弓形蟲SAG1基因的重組偽狂犬病病毒，本研究利用PCR技術(shù)擴(kuò)增弓形蟲主要保護(hù)性抗原基因SAG1，將其克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1，將含有SAG1基因的表達(dá)盒克隆入偽狂犬病病毒基因缺失轉(zhuǎn)

2、移載體，經(jīng)同源重組獲得了表達(dá)弓形蟲SAG1基因的重組偽狂犬病病毒。 真核表達(dá)載體的構(gòu)建利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出弓形蟲主要保護(hù)性抗原基因SAG1，克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1，經(jīng)酶切鑒定及序列分析，構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA/SAG1。 重組偽狂犬病毒的構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA/SAG1經(jīng)雙酶切獲得SAG1基因表達(dá)盒(上游為CMV啟動(dòng)子，下游為BGH ployA信號)，并將其克隆入偽狂犬病病毒轉(zhuǎn)移載體p8KD，構(gòu)建中間

3、轉(zhuǎn)移載體p8KD/SAG1。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，將中間轉(zhuǎn)移載體p8KD/SAG1與偽狂犬病毒rPRV/LacZ基因組共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，獲得攜帶SAG1基因的重組偽狂犬病病毒rPRV/SAG1。 重組偽狂犬病毒的鑒定分別提取重組病毒rPRV/SAG1基因組DNA和總RNA，運(yùn)用SAG1特異性引物進(jìn)行PCR及RT-PCR，結(jié)果擴(kuò)增出特異性目的條帶。經(jīng)Western blot和間接免疫熒光試驗(yàn)證實(shí)，重組病毒表達(dá)的SAG

4、1蛋白能被抗弓形蟲的多克隆陽性血清識別。重組病毒rPRV/SAG1的穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，該病毒在體外連續(xù)傳20代，仍能檢測到SAG1的表達(dá)，說明rPRV/SAG1具有較好的遺傳穩(wěn)定性。 動(dòng)物保護(hù)性試驗(yàn)為鑒定rPRV/SAG1的免疫保護(hù)效果，以BALB/c小鼠進(jìn)行了免疫保護(hù)性試驗(yàn)。 結(jié)果表明，真核表達(dá)載體pcDNA/SAG1及重組病毒rPRV/SAG1能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性的IgG抗體，產(chǎn)生較高水平的IL-2和IFN-γ；并且p