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文檔簡介
1、【背景】
漢灘病毒(Hantaan virus,HTNV)在我國主要引起腎綜合征出血熱(Hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS),該病危害極為嚴(yán)重,目前尚缺乏特效的治療藥物,主要使用疫苗進(jìn)行預(yù)防。目前我國已成功研制 HFRS滅活疫苗,其推廣使用對(duì)預(yù)防HFRS的發(fā)生和流行起到了積極作用。但該類疫苗仍存在一些問題,主要是不能有效刺激細(xì)胞免疫應(yīng)答,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的能力也較弱,抗體滴
2、度不高等,因而研發(fā)新型的HFRS疫苗成為當(dāng)務(wù)之急。近年來,病毒樣顆粒(Virus-like Particle,VLP)疫苗由于其安全性好和免疫原性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)使得其成為目前最有發(fā)展前景的新型基因工程候選疫苗之一。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)通過對(duì)VLP進(jìn)行修飾,將細(xì)胞因子錨定到VLP表面使其成為嵌合VLP可以使其具有更好的免疫原性。本研究通過桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)(Baculovirus expression vector system,BEVS)分別表達(dá)H
3、TNV包膜糖蛋白(Glycoprotein,GP)和核衣殼蛋白(Nucleocapsid protein,NP)來構(gòu)建HTNV VLP,同時(shí)表達(dá)糖基磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidylinositol,GPI)錨定的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulatingfactor,GM-CSF)或CD40配體(CD40 Ligand,CD40L),使之修飾在VL
4、P表面,獲得了兩種HTNV嵌合VLP(VLP-GM-CSF,VLP-CD40L),并對(duì)其生物學(xué)活性和免疫學(xué)特性進(jìn)行了研究,以期為進(jìn)一步研制HFRS新型基因工程疫苗奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【方法】
將HTNV76-118株編碼GP的M基因和編碼NP的S基因以及小鼠的GPI-GM-CSF(以下簡稱GM-CSF)、CD40L基因分別克隆入BEVS中的pFastBacTM Dual轉(zhuǎn)移載體中,構(gòu)建各重組桿狀病毒(recombi
5、nant Baculovirus,rBV)轉(zhuǎn)移載體(pFastBacTM Dual-M、pFastBacTM Dual-S、pFastBacTM Dual-GM-CSF、pFastBacTM Dual-CD40L),酶切后瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定,并進(jìn)行序列測(cè)定。將構(gòu)建好的各rBV轉(zhuǎn)移載體分別轉(zhuǎn)化大腸埃希菌(Escherichia coli,E.coli)DH10BacTM后提取各rBV桿粒,即Bacmid-M、Bacmid-S、Bacm
6、id-GM-CSF、Bacmid-CD40L,并利用PCR進(jìn)行鑒定。將構(gòu)建好的各rBV桿粒轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞后獲得各rBV,分別命名為rBV-M、rBV-S、rBV-GM-CSF、rBV-CD40L。取各rBV感染sf9昆蟲細(xì)胞,利用間接免疫熒光法(Indirect immunofluorescence assay,IFA)檢測(cè)各目的蛋白的表達(dá)。
將rBV-M、rBV-S以及rBV-GM-CSF或rBV-CD40L通過共感染s
7、f9昆蟲細(xì)胞的方式分別制備各組VLP(VLP、VLP-GM-CSF、VLP-CD40L),在電鏡下觀察sf9昆蟲細(xì)胞內(nèi)及培養(yǎng)上清中的各組VLP的組裝情況。分別大量制備和收集各組VLP,通過蔗糖密度梯度離心法純化各組 VLP,并利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linked immunoadsordent assay,ELISA)、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfatepolyacrylamid
8、e gel electrophoresis,SDS-PAGE)、蛋白質(zhì)印跡法(Western blot,WB)、免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)等方法進(jìn)行鑒定。
在上述工作的基礎(chǔ)上,研究分析了各組VLP的生物學(xué)活性及免疫學(xué)特性。通過流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry,FCM)分別檢測(cè)了各組VLP促小鼠骨髓細(xì)胞增殖能力、促小鼠骨髓細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DC)
9、分化能力以及促B淋巴細(xì)胞活化能力。將各組VLP通過皮下注射途徑免疫C57BL/6小鼠,以添加外源重組細(xì)胞因子的VLP(VLP+GM-CSF、VLP+CD40L)、HFRS滅活疫苗以及PBS為對(duì)照。通過ELISA及微量細(xì)胞中和試驗(yàn)分別檢測(cè)免疫后各組小鼠血清中抗HTNV GP及NP的特異性抗體及中和抗體的滴度,以反映各組小鼠的體液免疫應(yīng)答的情況;通過酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(Enzyme Linked Immunospot assay,ELISPO
10、T)及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)殺傷試驗(yàn)分別檢測(cè)免疫后各組小鼠脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的水平以及其CTL殺傷活性,以反映各組小鼠的細(xì)胞免疫應(yīng)答的情況;取HTNV76-118株通過肌肉注射途徑接種各組免疫小鼠,通過ELISA及實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)分別檢測(cè)接種后各組免疫小鼠臟器組織中H
11、TNV抗原及核酸,通過蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin,HE)染色各組小鼠臟器組織并進(jìn)行鏡檢,觀察接種后各組免疫小鼠臟器組織的病理學(xué)變化,以評(píng)價(jià)各組VLP預(yù)防接種對(duì)HTNV感染的保護(hù)作用。
【結(jié)果】
將各目的片段克隆入BEVS轉(zhuǎn)移載體后,酶切鑒定結(jié)果顯示,各rBV轉(zhuǎn)移載體均切出與相應(yīng)目的基因大小相一致的核酸條帶;測(cè)序結(jié)果顯示,各目的基因序列正確,無突變產(chǎn)生,表明成功地構(gòu)建了各rBV轉(zhuǎn)移載體。對(duì)重組桿粒
12、PCR鑒定結(jié)果顯示,各rBV桿粒中均擴(kuò)增出與預(yù)期大小相一致的核酸條帶,證實(shí)各組rBV桿粒構(gòu)建正確。將各重組桿粒轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞獲得 rBV,感染細(xì)胞后 IFA檢測(cè)結(jié)果顯示,各組rBV均可表達(dá)相應(yīng)的目的蛋白。
將各rBV共感染昆蟲細(xì)胞后,電鏡觀察結(jié)果顯示,在昆蟲細(xì)胞內(nèi)及培養(yǎng)上清中均可清楚地觀察到直徑大小約為80~220nm的顆粒,初步判定為各組 VLP。大量制備各組 VLP,利用蔗糖密度梯度離心進(jìn)行純化,離心結(jié)束后能夠清晰的觀察到各
13、組VLP的聚集帶。SDS-PAGE及WB檢測(cè)各組VLP,結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組VLP中均含有與相應(yīng)目的蛋白大小相一致的特異性蛋白條帶。ELISA及 Co-IP檢測(cè)結(jié)果顯示,在嵌合VLP中,GM-CSF或CD40L均成功地錨定在VLP上。
對(duì)各VLP進(jìn)行生物學(xué)活性檢測(cè)的結(jié)果顯示,各組VLP均可刺激小鼠骨髓細(xì)胞的增殖和向DC的分化,并有效地促進(jìn)了小鼠B淋巴細(xì)胞的活化,且VLP-GM-CSF的刺激能力要強(qiáng)于VLP-CD40L和VLP(p<0.
14、05)。對(duì)各VLP免疫小鼠進(jìn)行免疫學(xué)活性檢測(cè)的結(jié)果表明,各組VLP均可刺激C57BL/6小鼠產(chǎn)生針對(duì)HTNV GP、NP的特異性抗體以及中和抗體,且VLP-CD40L和VLP-GM-CSF組抗體滴度均高于VLP組、滅活疫苗組,以及相應(yīng)的外源細(xì)胞因子添加組 VLP+CD40L、VLP+GM-CSF,其中VLP-CD40L組抗體滴度最高(p<0.05)。在HTNV GP或NP刺激下,與PBS組相比,各組 VLP均可增強(qiáng)小鼠脾細(xì)胞分泌 IFN
15、-γ和IL-2的水平,且 VLP-CD40L、VLP-GM-CSF組小鼠脾細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-2水平均高于VLP組、滅活疫苗組,以及相應(yīng)的外源細(xì)胞因子添加組,其中 VLP-CD40L組分泌水平最高(p<0.05),而各免疫組小鼠脾細(xì)胞分泌IL-4和IL-10的水平無明顯差異(p>0.05)。在HTNV GP或NP刺激下,與PBS組相比,各組VLP均可增強(qiáng)小鼠脾細(xì)胞的殺傷活性,且隨著效靶比(Effector cell/Target
16、cell,E/T)的升高而增強(qiáng)。VLP-CD40L、VLP-GM-CSF組小鼠脾細(xì)胞殺傷活性在不同E/T時(shí)均高于VLP組、滅活疫苗組,以及相應(yīng)的外源細(xì)胞因子添加組,其中VLP-CD40L組殺傷活性最高(p<0.05)。
免疫小鼠保護(hù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,PBS對(duì)照組小鼠的肝臟、脾臟和腎臟組織中的HTNV抗原檢測(cè)均為陽性,而其他各實(shí)驗(yàn)組以及正常對(duì)照組小鼠的所有臟器組織均未檢測(cè)到HTNV抗原。RT-PCR檢測(cè)各組小鼠臟器中HTNV核酸的
17、結(jié)果與病毒抗原結(jié)果結(jié)果相一致。HE染色鏡檢結(jié)果顯示,PBS組小鼠的脾臟中出現(xiàn)了彌漫性出血,淋巴細(xì)胞彌漫性浸潤以及白髓增多等病理學(xué)變化,而其他各實(shí)驗(yàn)組以及正常對(duì)照組小鼠的所有臟器組織均未觀察到病理學(xué)變化。上述結(jié)果提示,HTNV能夠感染未經(jīng)免疫的C57BL/6小鼠,而經(jīng)各VLP免疫后能夠保護(hù)小鼠免受HTNV的攻擊。
【結(jié)論】
本研究通過BEVS表達(dá)系統(tǒng)獲得了嵌合有GM-CSF或CD40L的HTNV VLP,各嵌合VLP均
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