綿羊梅迪-維斯納病毒核酸疫苗的制備及免疫學(xué)研究.pdf

1、Maedi-Visna病毒(Maedi-Visnavirus，MVV)是反轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬的成員之一，主要侵染宿主的單核/巨噬細(xì)胞系的細(xì)胞，以損害綿羊的多種器官為特征。臨床上以綿羊嚴(yán)重消瘦、呼吸困難、麻痹、跛行、由淋巴組織增生而致乳腺硬化、間質(zhì)性進(jìn)行性肺炎等為特征。梅迪—維斯納病最早于1915年在美國(guó)的蒙大拿被發(fā)現(xiàn)，目前呈世界性分布。該病潛伏期長(zhǎng)，可通過(guò)母羊哺乳及呼吸道和消化道廣泛傳播，無(wú)有效的藥物和疫苗對(duì)其進(jìn)行防制。從60年代后期開(kāi)

2、始，我國(guó)有報(bào)道綿羊梅迪—維斯納病的發(fā)生，并于1984年首次從血清學(xué)角度確定了該病在我國(guó)的存在，1985年從血清學(xué)陽(yáng)性的綿羊體內(nèi)分離到該病毒。該病的傳播對(duì)綿羊養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的危害。本實(shí)驗(yàn)鑒于此原因?qū)ξ宜４娴腗VV毒株進(jìn)行序列分析，并與該病毒其他毒株進(jìn)行了序列比較，及對(duì)其核酸疫苗進(jìn)行了免疫學(xué)研究，以確定該病毒的來(lái)源，對(duì)該病的防制奠定了基礎(chǔ)。 MVV基因的克隆目的：對(duì)保存的來(lái)源于美國(guó)的MVV毒株(暫時(shí)用MVV-am表示)的基因進(jìn)行

3、克隆、測(cè)序及序列分析，通過(guò)與原美國(guó)株MVV-85/34和親本株MVV-1514相比，確定其變異率，同時(shí)為其核酸疫苗的研究搭建平臺(tái)。方法：根據(jù)Genbank中發(fā)表的綿羊梅迪-維斯納病毒美國(guó)株85/34的基因組序列(檢索號(hào)：AY101611)設(shè)計(jì)合成了4對(duì)引物，用蛋白酶K法提取MVV前病毒DNA，對(duì)主要基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了克隆和測(cè)序。結(jié)果：與原美國(guó)株MVV-85/34相比，MVV-am在傳代過(guò)程中發(fā)生了變異，變異率約為

4、3.1％。其中MVV-am的LTR和pol基因相對(duì)變異較大，gag基因核心部分變異相對(duì)最小。和親本株MVV-1514相比變異較大，同源性約為90.1％，且發(fā)生了核苷酸的缺失。結(jié)論：我們保存的來(lái)源于美國(guó)的MVV毒株與原美國(guó)株MVV-85/34相比，核苷酸發(fā)生了變異，同源性大約為96.9％。而與親本株MVV-1514相比，核苷酸變異相對(duì)較大。 MVV主要保護(hù)性抗原基因的克隆和序列分析目的：針對(duì)MVV的主要保護(hù)性抗原gag基因(P51

5、)進(jìn)行克隆、序列分析及抗原性分析，以明確其抗原性，為MVV核酸疫苗的構(gòu)建奠定分子基礎(chǔ)。方法：根據(jù)國(guó)外發(fā)表的MVV美國(guó)株的gag基因及其核心片段的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，從MVV前病毒DNA中擴(kuò)增gag基因片段，將其插入到pEGM-Teasy克隆載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGM-T-gag，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定和比較分析。利用ATHENPROT軟件對(duì)其抗原性進(jìn)行比較和分析。結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)所克隆的gag基因與MVV美國(guó)株g

6、ag基因的核苷酸和氨基酸的同源性為別為98.2％和96.9％；gag基因核心片段編碼蛋白的抗原性與MVV-85/34及MVV-1514株基本一致。結(jié)論：克隆得到gag基因片段，且該基因編碼蛋白具有較高的抗原性。 MVV核酸疫苗真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)目的：構(gòu)建MVV核酸疫苗pcDNA5/TO-gag并轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，檢測(cè)核酸疫苗和重組質(zhì)粒在真核細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)的情況。方法：將克隆的gag基因片段亞克隆到真核表達(dá)載體pcDNA5

7、/TO中，構(gòu)建了MVV核酸疫苗pcDNA5/TO-gag。將上述質(zhì)粒以及空載體pcDNA5/TO用脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞48小時(shí)后，經(jīng)免疫組化、ELISA、westernblot及RT-PCR等方法檢測(cè)重組質(zhì)粒在COS-7細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果：免疫組化發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒pcDNA5/TO-gag轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞在細(xì)胞核周?chē)尸F(xiàn)棕色，說(shuō)明重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA5/TO-gag在COS-7細(xì)胞中有相應(yīng)蛋白的表達(dá)，而pcDNA5/TO

8、轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞沒(méi)有出現(xiàn)棕色，說(shuō)明沒(méi)有相應(yīng)蛋白的表達(dá)；用ELISA方法檢測(cè)上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液上清發(fā)現(xiàn)，pcDNA5/TO-gag轉(zhuǎn)染組為陽(yáng)性，而pcDNA5/TO為陰性，表明所克隆的保護(hù)性抗原基因可以在COS-7細(xì)胞中表達(dá)；RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)pcDNA5/TO-gag轉(zhuǎn)染組提取細(xì)胞mRNA后，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)大小約800bp的目的條帶，與gag基因核心片段大小相符，而pcDNA5/TO和對(duì)照組沒(méi)有檢出相應(yīng)條帶。Wester

9、nblot檢測(cè)可見(jiàn)大小約27ku的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。結(jié)論：MVV核酸疫苗pcDNA5/TO-gag可以在真核細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)。 核酸疫苗接種小鼠誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)目的：將構(gòu)建的含有MVV核酸疫苗pcDNA5/TO-gag單獨(dú)或用脂質(zhì)體作為佐劑共免疫小鼠，通過(guò)評(píng)價(jià)其誘導(dǎo)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，探討核酸疫苗的效果及脂質(zhì)體的免疫佐劑作用。方法：pcDNA5/TO-gag、pcDNA5/TO-gag和脂質(zhì)體、及pcDNA5/TO分別免疫

10、BALB/C小鼠，通過(guò)MTT比色法檢測(cè)免疫后第2、4和6周小鼠淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化值，用間接ELISA法檢測(cè)免疫小鼠血清MVV抗體產(chǎn)生水平及小鼠淋巴細(xì)胞IL-4和IFN-γ的分泌水平。結(jié)果：pcDNA5/TO-gag和脂質(zhì)體免疫組的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值最高，且pcDNA5/TO-gag單獨(dú)免疫組的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值與對(duì)照組亦有顯著差異(P＜0.05)；通過(guò)對(duì)免疫小鼠血清的ELISA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，pcDNA5/TO-gag和脂質(zhì)體組的抗體滴度最高，而免疫組與

11、對(duì)照組間有顯著差異(P＜0.05)；通過(guò)對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞分泌的IL-4和IFN-γ檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，pcDNA5/TO-gag和脂質(zhì)體組的小鼠淋巴細(xì)胞IL-4和IFN-γ分泌水平高于單獨(dú)免疫組，單獨(dú)免疫組與對(duì)照組也有顯著差異(P＜0.05)。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的含有MVVgag基因的核酸疫苗免疫小鼠后可誘導(dǎo)特異性體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，核酸疫苗具有免疫反應(yīng)性。脂質(zhì)體對(duì)MVV核酸疫苗具有明顯的免疫佐劑作用。 羊IL-2對(duì)MVV核酸疫苗免疫效果的

12、影響目的：構(gòu)建含有IL-2基因的真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞確定其在真核細(xì)胞中能夠瞬時(shí)表達(dá)，與核酸疫苗pcDNA5/TO-gag共免疫小鼠，檢測(cè)其免疫佐劑效應(yīng)。方法：用PCR方法從pBV220/IL-2質(zhì)粒中擴(kuò)增IL-2基因，并亞克隆至真核表達(dá)載體pcDNA5/TO，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA5/TO-IL-2。pcDNA5/TO-IL-2轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后48小時(shí)后，用山羊IL-2檢測(cè)試劑盒以ELISA方法及RT-PCR方法檢測(cè)

13、pcDNA5/TO-IL-2在COS-7細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)情況。將重組質(zhì)粒pcDNA5/TO-IL-2與pcDNA5/TO-gag同時(shí)免疫BALB/C小鼠后，用MTT比色法檢測(cè)特異性淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值、ELISA方法檢測(cè)抗體滴度及淋巴細(xì)胞的IFN-γ和IL-4的分泌水平。結(jié)果：pcDNA5/TO-IL2組轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞裂解物上清ELISA反應(yīng)為陽(yáng)性，pcDNA5/TO組為陰性；經(jīng)RT-PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的mRNA，pcDNA5/TO

14、-IL-2組有500bp的目的片段出現(xiàn)，而pcDNA5/TO組未擴(kuò)增出該大小的片段。pcDNA5/TO-IL-2與pcDNA5/TO-gag聯(lián)合免疫組的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值最高，且與對(duì)照組有顯著差異(P＜0.05)；通過(guò)對(duì)免疫小鼠血清的ELISA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，pcDNA5/TO-IL-2與pcDNA5/TO-gag聯(lián)合免疫組的抗體滴度較pcDNA5/TO-gag單獨(dú)免疫組略有上升，而免疫組與對(duì)照組間有顯著差異(P＜0.05)；通過(guò)對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞分

15、泌的IL-4和IFN-γ檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，pcDNA5/TO-IL-2與pcDNA5/TO-gag聯(lián)合免疫組小鼠淋巴細(xì)胞IFN-γ分泌水平明顯高于其他組，而IL-4水平略高于pcDNA5/TO-gag單獨(dú)免疫組，而單獨(dú)免疫組與對(duì)照組相比有顯著差異(P＜0.05)。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒pcDNA5/TO-IL-2可以在COS-7細(xì)胞中表達(dá)，IL-2與核酸疫苗pcDNA5/TO-gag共同免疫小鼠可以刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖并使小鼠淋巴細(xì)胞