豬圓環(huán)病毒診斷及含CpG基序核酸疫苗對(duì)小鼠的免疫作用研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）屬于圓環(huán)病毒科，是一種小的、無(wú)囊膜的單鏈負(fù)股環(huán)狀DNA病毒。圓環(huán)病毒共有2個(gè)基因型，分別為無(wú)致病性的PCV1和有致病性的PCV2。PCV2病毒粒子侵入機(jī)體后可引起B(yǎng)淋巴細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的威脅。針對(duì)PCV2的鑒定和檢測(cè)已有許多方法，如ELISA、IFA、PCR等，但是這些方法過(guò)程繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)或者人為操作誤差較大。而熒光定量PCR技術(shù)具有快速、靈

2、敏、高特異性等特點(diǎn)，因此被越來(lái)越多的應(yīng)用于各種病毒的檢測(cè)。
　　 本研究利用普通PCR技術(shù)擴(kuò)增出PCV2的ORF2基因702bp片段，并克隆到pVAX1載體，以純化的質(zhì)粒作為PCR檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)模板，以10倍梯度稀釋質(zhì)粒為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，摸索熒光定量PCR試驗(yàn)，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以此建立一種熒光定量PCR特異性檢測(cè)豬圓環(huán)病毒的方法。結(jié)果表明，該方法對(duì)PCV2有很好的特異性，其敏感性比常規(guī)PCR高100倍，批間與批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)均小于2

3、.5％。經(jīng)臨床應(yīng)用表明熒光定量PCR方法的建立實(shí)現(xiàn)了對(duì)PCV2特異性的快速診斷和定量檢測(cè)。
　　 在利用豬腎臟細(xì)胞(PK-15)培養(yǎng)PCV2病毒中很容易污染無(wú)致病性的PCV1，給PCV2的純化與培養(yǎng)帶來(lái)困難。本研究還建立了一種多重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)技術(shù)以快速區(qū)分PCV1和PCV2。本研究設(shè)計(jì)了3條引物，其中D1是PCV1和PCV2共享引物。結(jié)果表明，PCV1和PCV2擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度(Tm)分別為84.5±0.20℃和86.6

4、±0.03℃，可以根據(jù)熔解峰的不同來(lái)區(qū)分。反應(yīng)的靈敏度分別可達(dá)到1×101拷貝/uL和1×102拷貝/uL，且與PRV、PRRSV和PPV無(wú)交叉反應(yīng)。此方法為監(jiān)控細(xì)胞毒的純化培養(yǎng)提供了簡(jiǎn)便快捷的方法。
　　 為了研究含CpG基序的核酸疫苗在小鼠體內(nèi)的免疫作用，將40只6周齡Balb/c小鼠隨機(jī)分為四組，其中:A組是PBS對(duì)照組，B組是pVAX1空載體組，C組是pVAX1-ORF2疫苗組，D組是18CpG-pVAX1-ORF2-疫

5、苗組。各組均采用肌肉注射，每次200μL，疫苗有效成分含量100μg，2周后按相同途徑和劑量進(jìn)行第二次免疫，二免后4周用0.2mL的PCV2SD株細(xì)胞培養(yǎng)物(106.0TCID50/ml)接種小鼠，檢測(cè)抗體變化情況并進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。試驗(yàn)結(jié)果表明，注射疫苗后各組小鼠沒(méi)有明顯癥狀，攻毒后A、B組小鼠呈現(xiàn)微觀剖檢病變，疫苗組無(wú)病變。核酸疫苗pVAX1-ORF2和18CpG-pVAX1-ORF2均有一定的免疫刺激作用，但18CpG-pVAX