含CpG基序重組質(zhì)粒的構(gòu)建及對豬口蹄疫疫苗的免疫增強(qiáng)作用研究.pdf

1、CpG寡核苷酸(CpGoligodexynucleotides，CpGODN)是一類在細(xì)菌中普遍存在的以非甲基化CpG為核心的DNA序列。已有研究表明，其通過Toll樣受體9(Toll-likereceptor9，TLR9)直接活化B細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，上調(diào)免疫刺激分子的表達(dá)，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)IL-6、IL-10以及IL-12等細(xì)胞因子分泌；此外還能間接激活NK細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞。因此CpGODN作為一種高效低毒的免疫激活

2、劑，成為免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)。 本研究在課題組篩選出的對豬外周血單核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcells，PBMC)具有最佳刺激活性的CpG基序(CpGmotif)的基礎(chǔ)上，人工合成了含有5拷貝CpG基序的寡聚脫氧核苷酸，并在兩端設(shè)計2對酶切位點(diǎn)。通過定向克隆和平末端克隆將其分步串聯(lián)到pcDNA3.0載體中，構(gòu)建出一組含有不同拷貝數(shù)(5、10、20、40、80拷貝)CpG基序的重組質(zhì)粒，分別命名為pc

3、DNAACpG-1、pcDNAACpG-2、pcDNAACpG-3、pcDNAACpG-4和pcDNAACpG-5。 1.用已構(gòu)建的pcDNAACpG-3、pcDNAACpG-4和pcDNAACpG-5按每孔1.25μg、2.5μg、5.0μg、10.0μg的劑量刺激豬PBMC，通過MTT比色法測定淋巴細(xì)胞的增殖能力和代謝強(qiáng)度進(jìn)行體外淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。通過比較各重組質(zhì)粒及同一質(zhì)粒在不同劑量下對豬PBMC的刺激效果，篩選出對豬具有

4、最佳免疫活性的重組質(zhì)粒及其劑量。結(jié)果顯示，三種質(zhì)粒對豬PBMC均產(chǎn)生了不同程度的刺激，與陰性對照組相比差異均顯著(P<0.05)，其中5.0μg的pcDNAACpG-3刺激指數(shù)達(dá)7.377，表明pcDNAACpG-3具有最佳的免疫刺激活性，最佳劑量為5.0μg。 2.利用高密度發(fā)酵大腸桿菌與大規(guī)模純化DNA工藝獲得大量pcDNAACpG-3重組質(zhì)粒。分別用500μg和250μg的pcDNAACpG-3重組質(zhì)粒與O型口蹄疫(foo

5、tandmouthdisease，F(xiàn)MD)滅活疫苗聯(lián)合免疫仔豬，以分析pcDNAACpG-3重組質(zhì)粒對O型FMD滅活疫苗免疫效果的影響。將32頭30日齡健康仔豬隨機(jī)分為4組，分別為生理鹽水組，疫苗對照組，250μg聯(lián)合免疫組，500μg聯(lián)合免疫組。在免疫后0天、14天、28天、42天、56天、70天、84天前腔靜脈采血并分離血清，采用液相阻斷ELISA法檢測血清中的FMDV特異性抗體效價。結(jié)果表明：500μg和250μg聯(lián)合免疫組仔豬在