CpG特征序列的篩選及CpG復(fù)合物免疫增強(qiáng)作用的研究.pdf

1、　　目的： 篩選出對新生兒單個(gè)核細(xì)胞具有較強(qiáng)免疫增強(qiáng)作用的CpG特征序列,即含非甲基化CpG二核苷酸的寡脫氧核苷酸鏈(oligodeoxynucleotides,CpG ODN)；采用分子偶聯(lián)技術(shù)合成CpG復(fù)合物{CD40L(CD40 ligand,CD40配體)-EDC{1-Ethyl-3[(3-aimethylamino)propyl]carbo-diimide methiodide,1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞

2、胺)-pLL(poly-l-lysine,多聚賴氨酸)-CpG ODN},提高細(xì)胞對CpG ODN的攝取率,增強(qiáng)CpG ODN的免疫刺激活性。 方法： 1.根據(jù)CpG ODN的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),設(shè)計(jì)合成15條CpG ODN序列,以國外篩選出的對人具有明顯免疫增強(qiáng)作用的CpG2006和國內(nèi)篩選出的T8為陽性對照,免疫新生兒臍血單個(gè)核細(xì)胞,MTT法檢測CpG ODN對單個(gè)核細(xì)胞的刺激增殖作用。 2.利用分子偶聯(lián)技術(shù)合成CpG200

3、6復(fù)合物 采用國內(nèi)外公認(rèn)的對人具有明顯免疫增強(qiáng)作用的CpG2006,通過分子偶聯(lián)技術(shù)合成CpG2006復(fù)合物(CD40L-pLL-CpG2006)。交聯(lián)劑碳二亞胺(EDC)促進(jìn)CD40配體(CD40L)與多聚賴氨酸(pLL)脫水縮合形成帶正電荷的CD40L-pLL,CD40L-pLL與帶負(fù)電荷的CpG2006通過靜電作用形成CpG2006復(fù)合物(CD40L-pLL-CpG2006)。MTT法檢測CpG2006復(fù)合物對新生兒單個(gè)核2

4、004屆碩士學(xué)位論文摘要細(xì)胞的免疫刺激增殖作用；EUSA法檢測細(xì)胞分泌IgG抗體的水平；流式細(xì)胞儀檢測單個(gè)核細(xì)胞對epo2006的攝取率,分析CD19、CD20、CD22及CD3的表達(dá)水平。 3.比較cpG2006復(fù)合物、CpGI復(fù)合物和CpG6復(fù)合物的免疫刺激活性 將篩選出的對新生兒具有較強(qiáng)免疫刺激作用的CpGI和CpG6,利用分子偶聯(lián)技術(shù)合成epGx復(fù)合物(CD40L一pLL一CpGI)和CpG6復(fù)合物(CD4oL一pL

5、L一CpG6),以CpGZo06復(fù)合物(CD4oL一pLL一CpGZoo6)為對照,免疫新生兒單個(gè)核細(xì)胞,比較三者的免疫刺激活性。結(jié)果： 1.CpGI和CpG6對新生兒單個(gè)核細(xì)胞的刺激增殖作用強(qiáng)于TS,與CpGZO06相當(dāng)。 2.合成epG2006復(fù)合物(CD4oL一pLL一CpG2006) 3.5%sDs一PAGE顯示CD40L一pLL滯留于上樣孔中,在CD40L水平上未見條帶；1%瓊脂糖電泳發(fā)現(xiàn)20“Ll：16稀釋

6、的CD40L一pLL與10協(xié)L(濃度165林g/mL)的CpG20O6均勻混合后,全部滯留于上樣孔中,在CpGZO06水平上未見條帶,未見向負(fù)極的拖帶。 單個(gè)核細(xì)胞對CpG20o6復(fù)合物組中CpG2006的攝取率明顯高于CpG2006組(P<；0.05)；以MTT法檢測的吸光值A(chǔ)為指標(biāo)觀察單個(gè)核細(xì)胞的增殖情況,CpGZoo6復(fù)合物組的吸光值A(chǔ)(1 .700士0.256)高于CpGZo06組(1 .210士0.497),兩組間差

7、異顯著(尸<；0.05)；CpG2006復(fù)合物組IgG抗體濃度(林g/mL)(225.9士89.83)高于CpG2006組(160.9士15.16),但二者間差異不顯著(P>；0.os)：epoZoo6復(fù)合物組中CD19+細(xì)胞占單個(gè)核細(xì)胞的比例為59.05%,eDZo十、eD22十細(xì)胞比例高于90%,Cpo2006組中eD19+細(xì)胞為14.28%,CD20十、CD22+細(xì)胞所占比例均低于11%；兩組中CD3十細(xì)胞的比例沒有明顯差

8、異。 3.cpGZo06復(fù)合物、CpGI復(fù)合物和CpG6復(fù)合物的免疫刺激活性 單個(gè)核細(xì)胞對epoZoo6復(fù)合物組(CD40L一pLL一CpGZoo6)、CpGI復(fù)合物組 (eD4oL一pLL一CpGI)和CpG6復(fù)合物組(CD4oL一pLL一CpG6)中CpGZoo6、CpGI和cpG6的攝取率均高于80%,組間無明顯差別；單個(gè)核細(xì)胞對CpG6組中CpG62004屆碩士學(xué)位論文摘要的攝取率均高于單個(gè)核細(xì)胞對CpGZO06組

9、中CpGZo06的攝取率和單個(gè)核細(xì)胞對CpGI組中CpGI的攝取率。 CpGZo06復(fù)合物組、CpGI復(fù)合物組和CpG6復(fù)合物組中的CD19+細(xì)胞占單個(gè)核細(xì)胞的比例明顯高于CpGZo06組·CpGI組和CpG6組(P<；0.os),CpGI復(fù)合物組和CpG6復(fù)合物組IgG抗體水平均明顯高于CpGI組和cpG6組(P<；o.05)。CpGZo06復(fù)合物組、CpGI復(fù)合物組和CpG6復(fù)合物組IL一12抗體水平高于陰性對照組(尸&l