重組融合肽TBP5對DHV-1基因工程亞單位疫苗的免疫增強(qiáng)作用.pdf

1、鴨病毒性肝炎是由鴨肝炎病毒（DHV）引起雛鴨的一種急性、高致死性傳染病，發(fā)病急，傳播迅速，病程短和死亡率高；臨床表現(xiàn)為角弓反張，剖檢見肝腫大和大量的出血性斑點(diǎn)，主要通過接觸傳播，經(jīng)呼吸道亦可感染。DHV分為3個(gè)血清型，即1型（DHV-1）、2型（DHV-2）和3型（DHV-3），其中DHV-1是主要血清型。該病是危害養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一，在全國范圍內(nèi)都有不同程度的流行和發(fā)生，疫情較難控制，雖然鴨肝炎弱毒苗和滅活苗已在全國范圍內(nèi)大面

2、積推廣，但在實(shí)際生產(chǎn)過程中，免疫效果并不理想，鴨肝炎仍時(shí)有暴發(fā)，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來嚴(yán)重危害，對于該病的控制仍舊得不到顯著改善。本研究通過對DHV-1 VP1基因的擴(kuò)增，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E. coli BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得重組 VP1蛋白表達(dá)產(chǎn)物；同時(shí)利用噬菌體展示技術(shù)以重組DHV-1 VP1蛋白為靶蛋白，通過噬菌體隨機(jī)12肽庫篩選，結(jié)合ELISA鑒定和競爭抑制試驗(yàn)，篩選到能與其特異性結(jié)合的多肽；以重組融合肽

3、TP5-BP5（TBP5）配合DHV-1 VP1蛋白基因工程亞單位疫苗進(jìn)行雛鴨動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)，探討其對 DHV-1 VP1蛋白亞單位疫苗的免疫增強(qiáng)作用。主要試驗(yàn)內(nèi)容分為以下三個(gè)方面：
　　1、DHV-1 VP1基因的克隆及表達(dá)
　　通過引物F1和F2對DHV-1 VP1基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳后得到約714 bp大小條帶，克隆到 pET-32a載體，篩選重組表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng) EcoR I與 Xba I雙酶切

4、和 PCR進(jìn)行鑒定，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒 pET32a-VP1，并將重組質(zhì)粒pET32a-VP1轉(zhuǎn)化至E. coli BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng) SDS-PAGE分析顯示，pET-32a(+)-VP1誘導(dǎo)后表達(dá)約43.0KD大小的目的蛋白條帶（包含 TRX硫氧還蛋白），表明 DHV-1 VP1基因在大腸桿菌中獲得了表達(dá)。Western-blot分析結(jié)果顯示，在43.0KD處可見特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，本研究為 DHV-

5、1VP1蛋白基因工程亞單位疫苗的制備提供實(shí)驗(yàn)材料。
　　2、DHV-1 VP1蛋白特異性結(jié)合肽的篩選
　　利用噬菌體展示技術(shù)，并以DHV-1 VP1蛋白作為靶標(biāo)對噬菌體隨機(jī)12肽庫進(jìn)行3輪親和篩選，獲得20個(gè)單個(gè)噬菌體克隆，結(jié)合ELISA鑒定和競爭抑制試驗(yàn)，獲得與 DHV-1 VP1蛋白特異性結(jié)合的陽性噬菌體克隆 P4與 P6，提取其DNA進(jìn)行序列測定，結(jié)果顯示2個(gè)噬菌體陽性克隆插入的12肽氨基酸序列分別為，P4-12：LL

6、SPGTHHSPWP；P6-12：LLADTTHHRPWT，分析其保守序列為
　　THHXPW。通過MTT法分析獲得DHV-1 VP1蛋白結(jié)合肽P4-12與P6-12本身對鴨胚成纖維細(xì)胞的增殖均無明顯影響，通過測定病毒滴度和病毒拷貝數(shù)結(jié)果表明 P4-12和 P6-12均能顯著降低鴨胚成纖維細(xì)胞中的DHV-1病毒滴度和病毒拷貝數(shù)，表明多肽 P4-12和 P6-12顯著抑制 DHV-1在鴨胚成纖維細(xì)胞中的增殖，為進(jìn)一步探明 DHV-1

7、與宿主細(xì)胞的相互作用以及抗病毒制劑開發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)線索。
　　3、重組融合肽TBP5對DHV-1 VP1蛋白亞單位疫苗的免疫增強(qiáng)作用
　　將重組融合肽 TBP5配合 DHV-1 VP1蛋白亞單位疫苗，通過雛鴨的分組和免疫，通過檢測鴨體內(nèi)血清 IgG抗體、血清細(xì)胞因子（INF-γ、IL-4）水平、動(dòng)物免疫保護(hù)試驗(yàn)及 HE染色來評價(jià)重組融合肽 TBP5對 DHV-1 VP1蛋白亞單位疫苗的免疫增強(qiáng)作用。結(jié)果顯示，重組融合肽 TBP