結(jié)核桿菌hsp70在乙腦基因工程疫苗研制中的免疫增強(qiáng)作用.pdf

1、流行性乙型腦炎（簡(jiǎn)稱乙腦）屬于黃病毒科，引起人類或馬的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染以及豬的流產(chǎn)，能通過持續(xù)感染的蚊子傳播給人，并且主要在脊椎動(dòng)物宿主內(nèi)存在，特別是具有較高病毒血癥的豬和鳥類，在人類乙腦主要引起致死率較高的腦炎，致死率從20-50％，但是絕大多數(shù)的幸存者都具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)的后遺癥；在家養(yǎng)動(dòng)物如豬和馬，主要引起腦炎，流產(chǎn)甚至死亡。與黃病毒科的其它成員類似，為單鏈正股RNA，長度為11kb，編碼一個(gè)含多聚蛋白的開放性閱讀框，這個(gè)多聚蛋白可

2、通過蛋白酶切割成至少11個(gè)蛋白，該病毒的結(jié)構(gòu)蛋白包括衣殼蛋白，膜蛋白和囊膜蛋白，位于5’端三分之一的區(qū)域，而非結(jié)構(gòu)蛋白從NS1到NS5位于閱讀框其余的區(qū)域。
　　 目前用于豬的乙腦疫苗包括弱毒苗和滅活苗，但是有關(guān)它們的安全性，生產(chǎn)和使用費(fèi)用等問題越來越突出。WHO正在呼吁改善和研制新型乙腦疫苗，乙腦病毒的E蛋白與病毒和細(xì)胞受體結(jié)合，膜融合有關(guān)，也是引起中和抗體及宿主保護(hù)的主要免疫蛋白。結(jié)核桿菌熱休克蛋白70具有分子佐劑和載體效應(yīng)

3、，是結(jié)核桿菌的主要抗原成分之一，可誘導(dǎo)和增強(qiáng)機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫的發(fā)生，因此用該基因與一些傳染病或寄生蟲病病原體的抗原基因融合表達(dá)以制備疫苗，借助它的載體分子效應(yīng)和佐劑作用，以提高病原體抗原的免疫原性和疫苗的免疫預(yù)防效果。
　　 本文將結(jié)核桿菌熱休克蛋白70與乙型腦炎E蛋白主要抗原片段在畢赤酵母中進(jìn)行融合表達(dá)免疫小鼠，用以研究hsp70對(duì)免疫反應(yīng)的影響，此外還對(duì)結(jié)核桿菌hsp70與抗原肽以何種方式共同作用才能發(fā)揮其佐劑效應(yīng)進(jìn)行

4、了研究，根據(jù)報(bào)道結(jié)核桿菌hsp70分為兩個(gè)區(qū)域，N末端為ATPase區(qū)，C末端為肽連接區(qū)，其中肽連接區(qū)為hsp70中真正行使佐劑功能的區(qū)域，因此本文將E蛋白主要抗原片段與肽連接區(qū)進(jìn)行融合表達(dá)并免疫，研究肽連接區(qū)的分子佐劑功能；另外，將已報(bào)道的E蛋白上的中和表位與結(jié)核桿菌hsp70在大腸桿菌中融合表達(dá)，將其免疫效果與乙腦弱毒苗SA14-14-2進(jìn)行比較.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 1，結(jié)核桿菌熱休克蛋白70及其功能域肽連接區(qū)對(duì)乙型腦炎E

5、蛋白主要抗原片段引起的免疫反應(yīng)的影響。
　　 在本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的原核表達(dá)載體（含乙腦疫苗株SA14-14-2株E蛋白基因主要抗原片段）的基礎(chǔ)上用巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)，該片段長1113bp，編碼371個(gè)氨基酸殘基，將其亞克隆入酵母表達(dá)載體pPICZα-A，以電穿孔法轉(zhuǎn)化酵母X-33，用Zeocin平板篩選重組子，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS-PAGE和免疫印跡分析表達(dá)產(chǎn)物。由于糖基化不同，所表達(dá)產(chǎn)物有兩種，其相對(duì)分子質(zhì)量分別為44k

6、Da和50kDa，表達(dá)量較高，約為290mg/L，經(jīng)Western印跡驗(yàn)證，有較好的抗原性。
　　 由于hsp70能增強(qiáng)與其融合的抗原肽的免疫反應(yīng)，在本研究中還構(gòu)建了一個(gè)在畢赤酵母中表達(dá)的重組載體，將乙腦E蛋白的主要抗原片段融合到結(jié)核桿菌hsp70的N末端，此外，已有報(bào)道hsp70C末端的肽連接區(qū)具有刺激Th1分化因子，C-C細(xì)胞分化因子產(chǎn)生以及佐劑作用，而N末端的ATP酶區(qū)（Hsp701-358）不能刺激產(chǎn)生任何細(xì)胞因子，根據(jù)

7、上述結(jié)論，我們同時(shí)構(gòu)建了另一個(gè)融合表達(dá)載體，將乙腦E蛋白的主要抗原片段融合到hsp70肽連接區(qū)的N末端。將這兩種載體以電穿孔法轉(zhuǎn)化酵母X-33，每隔24h加甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS-PAGE和免疫印跡分析表達(dá)產(chǎn)物。E-hsp70表達(dá)量約為33mg/L，E-Bindingdomain表達(dá)量約為97mg/L，經(jīng)Western印跡驗(yàn)證，這兩種融合蛋白均有較好的抗原性。另外，在畢赤酵母中單獨(dú)表達(dá)了hsp70蛋白，表達(dá)量約為178mg/L。

8、　　 7-8周齡的BALB/C小鼠（均為雌性），分別在首免和首免后21天用PBS透析后的蛋白進(jìn)行免疫，共分為七組，每組10只，分別以5.7μg（50pmol）的E-hsp70融合蛋白，3.4μg（50pmol）E-binding portion融合蛋白，3.5μg（50pmol）的hsp70，2.2μg（50pmol）的E蛋白主要抗原片段，3.5μg（50pmol）的hsp70與2.2μg（50pmol）的E蛋白主要抗原片段以1:1混

9、合以及首免用2.2μg（50pmol）的E蛋白主要抗原片段加上等體積的完全弗氏佐劑，二免加不完全弗氏佐劑。通過測(cè)定抗體滴度，淋巴細(xì)胞增殖，mIL-2和mIFN-γ的含量以及中和試驗(yàn)表明E-binding portion與E-hsp70的免疫效果相近，這兩者均比E蛋白主要抗原片段單獨(dú)免疫效果好，但是這兩種融合蛋白的免疫效果均弱于E蛋白主要抗原片段加弗氏佐劑的效果，在E-hsp70融合蛋白免疫組中，抗JEV E蛋白主要抗原片段的IgG1和I

10、gG2a抗體滴度為1000.00和3981.07，這表明了該免疫反應(yīng)為Th1反應(yīng)型。
　　 2，結(jié)核桿菌熱休克蛋白70對(duì)乙腦E蛋白中和表位引起免疫反應(yīng)的影響以及與乙腦弱毒苗SA14-14-2免疫效果的比較。
　　 根據(jù)大腸桿菌偏嗜性密碼子原則，人工合成了該中和表位，其上游酶切位點(diǎn)為BcoRⅠ，下游為HindⅢ，將該表位連接到原核表達(dá)載體pET-32a（+）上，命名為pet-32a-epitope，用PCR擴(kuò)增hsp70基

11、因，將hsp70基因克隆入原核表達(dá)載體pet-32a-epitope的HindⅢ和XhoⅠ之間，從而得到融合表達(dá)載體pet-32a-epitops-hsp70，這兩種重組表達(dá)載體的表達(dá)在大腸桿菌BL21中，將含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21在50mlLB37℃中培養(yǎng)，加入終濃度為100ug/ml氨芐青霉素，當(dāng)菌液搖到OD600為0.6時(shí)，加入終濃度為1mMIPTG，在37℃中繼續(xù)搖14h，最后將大腸桿菌以6000rpm離心10min，用P

12、BS洗兩次，收集細(xì)菌，將其懸浮在PBS中，進(jìn)行超聲波破碎，以10，000rpm離心20min，將上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE，確定蛋白在上清中還是包含體中，結(jié)果表明這兩種蛋白均以包含體形式存在，將包含體在8M的尿素中過夜溶解，然后將上清進(jìn)行過柱。中和表位的分子量為24kDa，融合蛋白的分子量為94kDa，Western blot顯示這兩種蛋白均具有抗JEV的特異抗原性。
　　 為了評(píng)價(jià)發(fā)展一種有效的乙腦亞單位疫苗，以乙腦病

13、毒E蛋白上位于aa373-399的中和表位對(duì)小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)免疫，以及將該表位與結(jié)核桿菌hsp70在大腸桿菌中的融合表達(dá)產(chǎn)物免疫小鼠，根據(jù)大腸桿菌偏嗜性密碼子原則，人工合成了野毒株JaOArS982的中和表位并在大腸桿菌中表達(dá)，以該中和表位以及以白油作佐劑，融合蛋白及乙腦弱毒苗JEV SA14-14-2進(jìn)行腹膜內(nèi)免疫，融合蛋白免疫組產(chǎn)生了最高的抗中和表位抗體滴度并且其淋巴細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)，排在第二位的是以白油作佐劑的中和表位，第三位是單獨(dú)