豬圓環(huán)病毒2型的檢測(cè)及皂苷類化合物對(duì)核酸疫苗的免疫增強(qiáng)作用.pdf

1、豬圓環(huán)病毒(PCV)為無囊膜的單股環(huán)狀DNA病毒,屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬,分為1型(PCV1)和2型(PCV2)。PCV2與近年來發(fā)生的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)密切相關(guān),還常和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)等混合感染,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。迄今還沒有可以有效控制PCV2感染的方法。本文從PCV2的PCR檢測(cè)、序列分析及其與PRRSV混合感染的診斷、皂苷類化合物TSA和TSB對(duì)PCV2基因疫

2、苗的免疫佐劑作用等方面進(jìn)行了研究,研究結(jié)果對(duì)于深入探索PCV2感染的有效控制方法具有較為重要的意義。1豬圓環(huán)病毒2型的PCR檢測(cè)及其ORF2序列分析
　　 建立了一種檢測(cè)圓環(huán)病毒2型(PCV2)的PCR方法。根據(jù)GenBank上的基因序列,針對(duì)ORF2保守區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)引物,用這對(duì)引物對(duì)臨床上疑似多系統(tǒng)衰竭綜合癥(PMWS)的組織樣品進(jìn)行檢測(cè),PCV2陽性的病料中可以擴(kuò)增出一條692bp的特異性條帶,對(duì)其它病原的檢測(cè)結(jié)果為陰性。敏感

3、性測(cè)定結(jié)果表明,該P(yáng)CR方法可以檢測(cè)出3.3×10-2μg/ml PCV2 DNA。該方法的建立對(duì)于臨床上進(jìn)行PMWS的診斷具有重要意義。
　　 根據(jù)PCV2 ORF2基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物,對(duì)11頭PMWS可疑病豬病料的進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體上,得到pT-ORF2。測(cè)序后進(jìn)行比較,結(jié)果顯示核苷酸同源性為93.3％-100％,氨基酸同源性為91.5％-99.6％。這些基因序列同其它國(guó)內(nèi)(外)PCV2的ORF2

4、序列比較顯示,核苷酸和氨基酸的同源性分別為90％-100％和89.3％-99.6％。分子進(jìn)化分析結(jié)果表明,國(guó)內(nèi)流行的PCV2可以分為3群,10個(gè)毒株的序列與其它大多數(shù)國(guó)內(nèi)毒株和法國(guó)毒株形成一個(gè)比較大的群,只有1株和國(guó)內(nèi)一些毒株以及荷蘭毒株形成一個(gè)群,只有少數(shù)國(guó)內(nèi)的PCV2與美國(guó)、德國(guó)、日本、西班牙毒株形成一個(gè)小分支。2豬圓環(huán)病毒2型與豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征混合感染的診斷
　　 已有資料表明,PCV2單獨(dú)感染導(dǎo)致的疾病不會(huì)造成大

5、批豬發(fā)病或死亡。但是PCV2可以破壞免疫系統(tǒng),容易繼發(fā)其它一些病原,如豬繁殖與呼吸綜合征和豬瘟,使疾病復(fù)雜化,病情加重,死亡率升高。
　　 2001年杭州地區(qū)有三個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)陸續(xù)發(fā)生仔豬腹瀉、保育豬呼吸困難,剖檢發(fā)現(xiàn)肺部橡皮樣,全身淋巴結(jié)水腫、部分豬脾臟邊緣梗死,發(fā)病率、死亡率很高。我們?cè)O(shè)計(jì)了針對(duì)PRRSV、PCV2的特異性引物,進(jìn)行RT-PCR或PCR檢測(cè),分別應(yīng)用偽狂犬(PR)鑒別試劑盒檢測(cè)和免疫熒光法檢測(cè)PRV和CSFV,

6、經(jīng)過比較全面的檢查發(fā)現(xiàn)這些豬為PCV2合并PRRSV’或CSFV感染。3豬圓環(huán)病毒2型和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的熒光定量PCR檢測(cè)
　　 建立了基于SYBR Green檢測(cè)PCV2和PRRSV的熒光定量PCR方法。對(duì)PCV2和PRRSV的檢測(cè)下限和上限分別為103和1011拷貝；特異性比較好,不與PCV1、偽狂犬、細(xì)小病毒、傳染性胃腸炎病毒發(fā)生非特異性反應(yīng)。重復(fù)性好,PCV2定量PCR檢測(cè)的最大批次內(nèi)的變異系數(shù)為0.82％,批次

7、間為1.24％；PRRSV定量PCR檢測(cè)分別為1.27％和1.74％。
　　 通過對(duì)80份臨床樣品(40份來自正常豬,40份來自PMWS豬)的檢測(cè),常規(guī)PCR方法檢測(cè)呈PCV2陽性的56份病料熒光定量PCR也為陽性,而常規(guī)PCR方法檢測(cè)PCV2為陰性的24份病料中熒光定量PCR檢測(cè)為陽性的有12份。對(duì)于臨床樣本的PRRSV檢測(cè)表明,比常規(guī)RT-PCR靈敏度高出10-100倍,檢測(cè)的10份樣品常規(guī)方法檢出5份陽性,熒光定量方法檢出

8、6份為陽性。說明與傳統(tǒng)PCR方法相比,熒光方法更加敏感。4皂苷類化合物對(duì)豬圓環(huán)病毒2型核酸疫苗的免疫佐劑作用
　　 為了探討免疫佐劑對(duì)PCV2核酸疫苗的免疫效果,我們以pcDNA3為基礎(chǔ),構(gòu)建了PCV2的ORF2(PcO)、ORF2-eGFP(POG)和不含核定位信號(hào)序列的AORF2(PcJ)的DNA疫苗,并聯(lián)合皂苷類佐劑TSA或TSB免疫小鼠2次,DNA疫苗和佐劑每次免疫的劑量分別為100μg和75μg,二免后14天采血用EL

9、ISA方法檢測(cè)特異性IgG及其亞類IgG1和IgG2b；取脾臟以熒光PCR定量檢測(cè)脾細(xì)胞IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10 mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果顯示,所有重組質(zhì)粒免疫小鼠的血清特異性IgG、IgG1和IgG2b水平均高于pcDNA3空載體(P＜0.05或P＜0.01),3種重組質(zhì)粒中,以PcJ誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性抗體的作用最顯著,說明截短的ORF2的免疫效果優(yōu)于全長(zhǎng)ORF2。重組質(zhì)粒與TSA或TSB佐劑組的特異性Ig

10、G及IgG1的水平均顯著高于單純重組質(zhì)粒免疫組(P＜0.01):對(duì)3種重組質(zhì)粒免疫小鼠血清特異性抗體的佐劑作用TSA優(yōu)于TSB,TSA能顯著提高3種重組質(zhì)粒免疫小鼠血清中特異性IgG2b抗體水平(P＜0.05或P＜0.01),而TSB僅對(duì)PcJ質(zhì)粒免疫小鼠產(chǎn)生特異性IgG2b有促進(jìn)作用(P＜0.01),對(duì)PcO和POG質(zhì)粒免疫小鼠血清中特異性IgG2b抗體無顯著性影響(P＞0.05)。除IL-4以外,重組質(zhì)粒免疫組脾細(xì)胞IL-2、IFN

11、-γ和IL-10 mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著高于空質(zhì)粒對(duì)照組(P＜0.05或P＜0.01)；而三種重組質(zhì)粒間對(duì)這些細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有顯著差異。佐劑TSA和TSB均可顯著增強(qiáng)重組質(zhì)粒誘導(dǎo)的細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄(P＜0.01),而且佐劑TSA的作用比TSB強(qiáng)(P＜0.01,PcJ對(duì)IL-10的組合除外)。上述結(jié)果表明TSA和TSB不僅能顯著提高重組質(zhì)粒免疫小鼠血清中PCV2 ORF2特異性抗體水平,顯著促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞IL-4和IL-10 mRNA轉(zhuǎn)錄