SARS冠狀病毒免疫增強型核酸疫苗構(gòu)建及免疫效果評價.pdf

1、豬水腫病(Edemadiseaseofswine,ED)是由某些溶血性大腸桿菌引起斷奶仔豬的一種毒血癥。臨床特征為頭部和胃壁等處水腫、共濟失調(diào)、驚厥和麻痹等。該病發(fā)病急、死亡快,往往來不及治療,死亡率很高。豬水腫病的發(fā)生與大腸桿菌的F18ab菌毛與志賀毒素Ⅱ型變異體(Stx2e)密切相關(guān)。目前,對該病的防治主要采用大腸桿菌多價苗免疫和抗生素治療,但防治效果均不理想。卵黃抗體作為一類可替代抗生素的高效生物防治制劑在防治豬水腫病中顯示出明顯

2、的效果,為該病的防治開辟了新的途徑。
　　 本研究提取了F18ab菌毛蛋白與Stx2e,并利用原核表達技術(shù),分別獲得了F18ab菌毛與Stx2e的具有中和抗原表位的FedF重組蛋白和Stx2eB重組蛋白。分別以上述4種蛋白作為免疫原對6月齡海蘭蛋雞進行免疫。共進行3次免疫,每次間隔兩周。其中,Stx2e免疫組在一免時分為0.20mg/只和0.40mg/只兩個免疫劑量組,二免時,將一免的每個免疫劑量組再分為兩小組,兩個小組的免疫劑

3、量分別為該組一免時的免疫劑量和一免時免疫劑量的2倍,三免時,所有免疫組的免疫劑量均為二免時最高免疫劑量組的劑量:Stx2eB重組蛋白免疫組在一免時分為0.50mg/只和1.00mg,只兩個免疫劑量組,二免和三免的免疫方式同Stx2e免疫組;F18ab菌毛蛋白免疫組在一免時分為0.38mg/只和0.76mg/只兩個免疫劑量組,二免和三免的免疫方式同Stx2e免疫組;FedF重組蛋白免疫組三次免疫的劑量分別為1.00mg/只、2.00mg/

4、只、2.00mg/只。
　　 二免后一周收蛋并用氯仿抽提法提取卵黃抗體,用間接ELISA法檢測抗體效價。其中,以Stx2e、Stx2eB重組蛋白、F18ab菌毛蛋白、FedF重組蛋白作為免疫原的免疫組ELISA效價最高值分別為1:5120、1:5120、1:20480、1:1280,且高水平效價分別可維持6周、2周、4周、3周。安全性實驗結(jié)果顯示,4種卵黃抗體均達到《中國獸藥典》對獸醫(yī)生物制品的標準。吸附和吸附抑制試驗結(jié)果顯示,

5、抗F18ab菌毛蛋白卵黃抗體和抗FedF重組蛋白卵黃抗體分別與F18ab+大腸桿菌按1:1的體積比混合作用30min后,均能夠抑制F18ab+大腸桿菌對仔豬小腸上皮細胞的吸附,而未用卵黃抗體處理的F18ab+大腸桿菌可緊密的吸附于仔豬小腸上皮細胞表面。體外中和試驗結(jié)果顯示,抗Stx2e卵黃抗體和抗Stx2eB重組蛋白卵黃抗體均可以抑制Stx2e對Vero細胞的致病變作用,接種這2種卵黃抗體的Vero細胞和對照組相比仍有大量正常生長的細胞

6、,僅出現(xiàn)少量的死亡細胞。體內(nèi)中和試驗結(jié)果顯示,抗Stx2e卵黃抗體在原液、1:2、1:4三個稀釋濃度下,對昆明鼠的保護率分別為100％、60％、60％,抗Stx2eB重組蛋白卵黃抗體在原液、1:2、1:4三個稀釋濃度下,對昆明鼠的保護率分別為100％、60％、40％,而生理鹽水對照組和僅腹腔注射卵黃抗體的對照組昆明鼠生長正常,僅注射Stx2e對照組昆明鼠在48h內(nèi)死亡率達到80％。
　　 本研究還建立了環(huán)介導等溫擴增法(LAMP

7、)用來檢測Stx2e基因,根據(jù)GenBank中12條Stx2e序列和9條Stx2序列,針對Stx2e基因的保守區(qū)設(shè)計一套引物。以煮沸法處理的Stx2e+大腸桿菌過夜培養(yǎng)物為模板進行LAMP反應(yīng),所得擴增產(chǎn)物溶液變渾濁而對照管未發(fā)生變化。LAMP擴增產(chǎn)物電泳后呈特征性梯狀條帶,而陰性對照無擴增條帶,在LAMP體系中加入1μlSYBRGreenⅠ染料后,肉眼觀察時陽性管呈翠綠色,而陰性管則為淡橙色,紫外燈下,陽性管發(fā)出綠色熒光,而陰性管則無

8、顏色變化。經(jīng)反應(yīng)條件優(yōu)化后的LAMP方法在63℃反應(yīng)lh后可得最佳反應(yīng)效果。特異性試驗結(jié)果顯示,該LAMP方法僅對Stx2e+大腸桿菌產(chǎn)生特征性梯狀擴增條帶,而對LT+、ST+、Stx2+大腸桿菌檢測結(jié)果均為陰性。敏感性試驗結(jié)果顯示,該方法對Stx2e+大腸桿菌的最低檢出量為38CFU/管,是PCR方法敏感性的100倍。LAMP方法和PCR方法對模擬樣品檢測結(jié)果的符合率為100％。證明本法具有快速、特異和敏感的特點。
　　 本研