增強核酸疫苗免疫效果的策略及其作用機制的研究.pdf

1、核酸疫苗(DNA疫苗)是指將含有編碼抗原基因的真核表達載體直接接種體內(nèi)，在體內(nèi)表達相應(yīng)抗原刺激機體產(chǎn)生針對該抗原的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生保護性免疫。核酸疫苗由于其獨特的雙免疫激活作用而受到越來越多的關(guān)注，有一些核酸疫苗已經(jīng)進而Ⅱ期、Ⅲ期臨床研究，然而，核酸疫苗的免疫效果卻始終不甚理想，在動物實驗中，對于猴子、猩猩等大動物，疫苗用量過大，為此，探索增強核酸疫苗免疫效果及降低疫苗用量的策略研究是十分必要的。 劑型改造是提高DNA疫苗免疫效果

2、的方法之一。本課題中探討了一種新型的DNA疫苗給藥系統(tǒng)，用聚乳酸/羥基乙酸共聚物(PLGA)包裹DNA疫苗形成微球疫苗后免疫小鼠，觀察免疫后小鼠體液免疫、細胞免疫及粘膜免疫的效果。實驗中，以乙肝治療性DNA疫苗和多表位口蹄疫DNA疫苗為候選疫苗，應(yīng)用PLGA包裹形成微球疫苗，首先在體外實驗中驗證了疫苗微球?qū)乖f呈細胞的靶向作用。小鼠巨噬細胞系Raw264.7細胞被用于體外吞噬實驗，模擬抗原遞呈細胞對疫苗抗原的攝取過程。通過姬姆薩染色，

3、證實了微球疫苗的可吞噬性；熒光標記的疫苗微球的應(yīng)用，可以更準確的動態(tài)觀察微球的吞噬過程，在吞噬的2小時、4小時、8小時后分別收集細胞熒光顯微鏡觀察，可以看到隨著時間延長，細胞內(nèi)點狀熒光逐漸融合，熒光強度逐漸增加，進一步證實微球的可吞噬性。吞噬后的微球能否成功釋放疫苗，疫苗抗原能否正確表達?后續(xù)實驗中，在體內(nèi)、體外兩個層面上證實了抗原成份在抗原遞呈細胞中的正確表達。當應(yīng)用PLGA包裹的乙肝DNA疫苗口服免疫小鼠后，可全面的激發(fā)機體的細胞免

4、疫和體液免疫，還可在局部引流淋巴結(jié)中觀察到疫苗抗原的表達，觀察到體現(xiàn)粘膜免疫效果的IgA的分泌，充分證實了口服乙肝DNA疫苗良好的免疫效果，獲得了有應(yīng)用前景的口服治療性乙肝DNA疫苗。在多表位口蹄疫DNA疫苗的研究中發(fā)現(xiàn)，PLGA包裹可以降低疫苗的免疫劑量、減少疫苗的免疫次數(shù)，使新型口蹄疫DNA疫苗更廉價、使用更方便。 膜聯(lián)蛋白B1基因是本課題組以免疫篩選法從豬囊尾蚴cDNA文庫中得到的一個新基因，其基因產(chǎn)物是豬帶絳蟲囊蟲病的診

5、斷用抗原，也是很好的保護性抗原，以annexinB1為抗原基礎(chǔ)構(gòu)建的囊蟲DNA疫苗，在豬的保護性實驗中可保護仔豬免于蟲卵沖擊后的感染或提高減蟲率。對于一個高免疫原性的疫苗抗原，其結(jié)構(gòu)的解析、生物學活性的認識是安全、有效的利用疫苗抗原的基礎(chǔ)，為了找到能更好的增強囊蟲DNA疫苗免疫效果的新策略，本課題中構(gòu)建了annexinB1的結(jié)構(gòu)域突變體，對annexinB1及其突變體的生物學活性進行了深入研究，對annexinB1的免疫佐劑作用機制進行

6、了探討。實驗中利用新的脂膜模型證實了annexinB1的磷脂酰絲氨酸(PS)結(jié)合活性，激光共聚焦顯微鏡觀察了annexinB1與凋亡細胞的結(jié)合，放射性核素標記的annexinB1顯像了小鼠肝細胞凋亡，從細胞水平和分子水平證實了annexinB1與PS的結(jié)合是特異性的、鈣依賴性的，從體外到體內(nèi)驗證了annexinB1的細胞凋亡檢測活性，為將annexinB1開發(fā)成為可用于體內(nèi)外凋亡檢測的探針蛋白奠定了實驗基礎(chǔ)。 本課題綜合分析了a

7、nnexinB1的生物學活性，結(jié)合核酸疫苗基礎(chǔ)理論研究的新進展，探討了annexinB1作為核酸疫苗免疫佐劑的作用機制，初步分析是：PS分子是細胞凋亡早期的標志性分子，可通過PS受體介導凋亡細胞的清除，所以當annexinB1特異性結(jié)合到早期凋亡的抗原遞呈細胞表面的PS分子時，封閉了凋亡信號分子，可抑制凋亡清除細胞對抗原遞呈細胞的攻擊，延長抗原遞呈細胞在免疫局部和局部引流淋巴結(jié)中的存活時間，延長疫苗抗原的表達和遞呈時間，增強疫苗的免疫原

8、性，起到免疫佐劑的作用。 總之，本論文的實驗研究是圍繞如何提高DNA疫苗誘導的免疫應(yīng)答反應(yīng)這個核心問題開展工作，選擇了DNA疫苗新劑型策略，制備了可口服的乙肝治療性DNA疫苗，并激發(fā)了特異性粘膜免疫；PLGA包裹的多表位口蹄疫DNA疫苗可在較低劑量、單次免疫的情況下獲得良好的免疫效果，大大方便了口蹄疫疫苗的應(yīng)用，降低了免疫成本。研究中還發(fā)現(xiàn)，annexinB1依其對凋亡細胞清除信號分子PS的結(jié)合活性，可延長免疫局部抗原遞呈細胞的